植物叶绿体遗传转化研究

摘要

叶绿体(chloroplast)是高等植物细胞中重要的细胞器，它除进行光合作用外还参与脂肪酸、核苷酸、淀粉和氨基酸等许多物质的生物合成。叶绿体还是一个半自主性的细胞器，含有自己的基因组DNA(ctDNA)，能够进行自我复制、转录及合成蛋白质，至少有100余种叶绿体特有的蛋白质是在叶绿体内部合成的。与传统的核转化相比，叶绿体转化具有无可比拟的优越性。这一领域的相关研究不仅在理论上极大地丰富了有关叶绿体的研究，并为细胞器转化、构建新型生物反应器(bioreactor)等奠定了坚实的基础。
　　 Sidorov等的研究表明：在漫长的演变进化过程中，叶绿体基因组的结构非常保守。在作物之间，不一定必须构建特定的载体进行转化。因此，本研究在含有壮观霉素抗性(spectinomycin resistance)基因及绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因的烟草叶绿体表达载体pDK53的基础上，连入能够长期稳定存在的黄瓜线粒体类质粒pC3全序列，构建黄瓜叶绿体表达载体pDK53-pC3，以期增加黄瓜叶绿体转化过程中载体整合或独立存在的机会。
　　 本研究以“津研4号”黄瓜为试材，首先分离纯化黄瓜叶绿体，摸索其体外培养条件，通过显微观察、台盼蓝染色、希尔反应及I2-KI染色等方法检测叶绿体体外培养效果，取得了较为理想的结果。进一步向培养体系中添加氨基酸、激素、各种营养物质以及改变培养体系pH等以期优化叶绿体体外培养条件，但并未取得明显效果。
　　 对黄瓜离体叶绿体的电转化条件进行探索，用电转化方法将构建的带有外源基因的表达载体转入黄瓜离体叶绿体中，通过PCR扩增外源基因g，证明叶绿体表达载体pDK53、pDK53-pC3已经成功转入离体的黄瓜叶绿体中，并且叶绿体在体外培养18天甚至更长时间时，转入的外源DNA仍然可以检测到。但是，质粒在离体叶绿体中的存在方式、外源基因的转录及表达情况尚未可知，确切的结论还有待进一步研究。
　　 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)含有1个大型杯状叶绿体，约占整个细胞体积的40％～60%。本研究以莱茵衣藻细胞壁和精氨酸缺陷型CW15品系为试材，采用电转化方法将烟草叶绿体表达载体pDK53导入衣藻叶绿体中，通过PCR扩增外源基因gfp和荧光显微镜观察，证明叶绿体表达载体pDK53已经成功转入衣藻叶绿体中。但是在对衣藻转化子进行同质化筛选过程中，外源基因丢失了。
　　 此外，本研究以“津研4号”黄瓜子叶和下胚轴为外植体，比较了外植体切割和接种方式以及不同植物生长调节物质组合对不定芽的诱导、伸长、生根的影响。结果表明，子叶能够直接再生出芽；下胚轴只长愈伤组织，没有见到芽的分化。最佳的芽诱导培养基为：MS+6-BA2mg/L+IAA0.5mg/L；伸长培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+ GA30.5mg/L；生根培养基为MS或1/2MS。