小鼠非清髓骨髓细胞移植诱导免疫耐受及抗肝癌研究

摘要

背景：肝移植对肝癌的疗效已得到了充分的证实，但移植后长期使用抗排斥药物带来的一系列并发症仍是当前移植学的一大难题。有研究表明实体器官联合供体非清髓骨髓细胞移植可以通过建立供受体免疫细胞混合嵌合(mixedchimcrism)，进而诱导免疫耐受。近年来，活体肝移植的开展使得获得供体骨髓细胞成为可能。探讨通过活体肝移植联合供体骨髓细胞移植，建立混合嵌合，实现免疫耐受有着极其重要的意义。机体内重要的免疫调节细胞Treg和Th17在诱导耐受过程中的作用尚待阐明。非清髓同种异基因骨髓细胞移植(Non-myeloablative allogeneic bone marrow cells transplantation,N-Allo-BMT)同时对肾细胞癌、乳腺癌的有着肯定的疗效，但对肝癌的作用尚不清楚。
　　 目的：利用N-Allo-BMT诱导小鼠双向免疫耐受，探讨Treg及Th17细胞在该过程中的作用；观察N-Allo-BMT对小鼠肝癌的作用，并探讨其作用机制。
　　 方法：第一部分：采用60Co联合单次环磷酰胺注射为预处理方案，以眼球后静脉为细胞移植途径。瑞式染色观察造血恢复情况；流式细胞计数(fluorescencecytometrym，FCM)观察移植细胞存活情况；记录移植物抗宿主疾病（graft versushost disease，GVHD）。获得长期存活受体后，皮肤移植验证耐受状态。对比严重GVHD受体，免疫耐受受体脾脏中IL-17，IL-10，FOXP3及TGF-beta表达情况。第二部分：建立N-Allo-BMT模型，皮下接种H-22肝癌细胞，观察各组成瘤时间、肿瘤生长情况、终末肿瘤体积、Kaplan-merrier生存评估。对比肿瘤组织中淋巴细胞、血管密度及VEGF-A(vascular endothelium growth factor-A)表达情况。
　　 结果：第一部分：小鼠眼球后静脉注射移植细胞50例，成功率100％，无并发症发生。仅接受预处理未行细胞移植小鼠（8只）无死亡发生，在14天后开始恢复造血。细胞移植7-10天后受体造血功能恢复，15天时所有受体免疫细胞为供体完全嵌合。81.1%(18/22)受体在移植后30-60内死于严重的GVHD，18.9%(4/22)受体存活超过120天，9.1%的受体经皮肤移植后证实达到免疫耐受状态，其免疫细胞为供受体混合嵌合。严重GVHD受体脾脏中IL-17明显高表达(p<0.01)。耐受受体IL-17明显低表达，且其Foxp3及TGF-bem表达量明显升高(p<0.Ol)。第二部分：各组成瘤时间差别无统计学意义，N-Allo-BMT受体中肿瘤生长明显缓慢(p<0．Ol)，且体积明显减小(p<0．01)，但总体生存期并无提高(p>0.05)。N-Allo-BMT受体肿瘤组织中CD4+及CD8+淋巴细胞明显高于其余各组(p　　 结论：第一部分：低剂量60Co+单次大剂量腹腔注射CTX，可作为经济、简便的非清髓预处理方案；眼球后静脉注射可替代尾静脉注射，作为小鼠细胞移植的途径；该模型可诱导出约9.1%的免疫细胞混合嵌合的免疫耐受受体，Treg及11117细胞在该过程起重要作用。第二部分：N-Allo-BMT可以明显抑制小鼠肝癌生长，但并不能延长生存期，严重的GVHD是应用该方法的重要障碍。N-Allo-BMT受体肿瘤组织中血管密度及VEGF-A表达明显低于其余各组，提示其抑制肿瘤生长的效应可能主要是通过抑制肿瘤组织内新生血管的生成，而不是直接对肿瘤细胞的杀伤起作用。既然N-Allo-BMT具有诱导免疫耐受和抗肝癌作用的两方面潜能，我们提出对不能通过传统肝切除治疗的肝癌患者，施行活体肝移植．非清髓供体骨髓细胞联合移植有可能到达在实现供受体双向免疫耐受的前提下，产生针对肿瘤的第三方免疫杀伤作用。而利用药物或基因修饰的方法调节Treg细胞或Thl7细胞的分化，有可能是促进耐受形成，避免产生严重GVHD的有效途径之一。