HBXIP调节乳腺癌细胞迁移的分子机制及其蛋白纯化条件的探索

摘要

乙肝病毒X蛋白结合蛋白（Hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）因可与乙肝病毒X蛋白（hepatitis Bvirus xprotein，HBx）的羧基端特异性结合而得名，在细胞凋亡及有丝分裂等细胞生命活动过程中发挥重要作用。我们发现，HBXIP也能促进乳腺癌细胞迁移，但其分子机制尚不清楚。MicroRNA(miRNAs)作为一类小分子非编码RNA，可以参与肿瘤发生、发展等诸多生命活动。本室前期研究发现，在不同转移潜能的乳腺癌细胞系中，HBXIP和miR-520b的表达水平均存在差异，且二者在表达量上呈负相关。本研究以不同转移能力的人乳腺癌细胞系MCF-7、LM-MCF-7及MDA-MB-231为材料，探讨了HBXIP促进乳腺癌细胞迁移的分子机制，并对HBXIP的纯化条件进行了初步探索，主要研究内容如下：
　　 1．HBXIP调节乳腺癌细胞迁移的分子机制
　　 在前期研究基础上，应用western blot及实时定量PCR法分别检测了三种不同转移能力乳腺癌细胞系中HBXIP和miR-520b的表达水平，发现具有高转移潜能的LM-MCF-7及MDA-MB-231细胞中的HBXIP表达水平明显高于低转移的MCF-7细胞，而miR-520b的表达水平则明显低于MCF-7细胞。这表明HBXIP可能促进乳腺癌细胞迁移，而miR-520b可能抑制乳腺癌细胞迁移。近年来，HBXIP一直是本室的研究重点，为了阐释HBXIP促进乳腺癌细胞迁移的分子机制，我们应用生物信息学方法进行了预测，发现HBXIP是miR-520b的靶基因之一。接下来，我们克隆了含HBXIP3’-untranslated region(3'UTR)或其3'UTR突变体的报告基因载体，双荧光素酶报告基因实验及western blot检测结果显示，miR-520b可以靶向HBXIP的3'UTR，影响HBXIP的表达水平。在LM-MCF-7细胞系中共转染miR-520b及pCMV-hbxip-3'UTR（或pCMV-hbxip）后检测细胞的迁移能力，发现，当HBXIP的表达水平被miR-520b下调后，LM-MCF-7细胞系的迁移能力也随之降低，表明HBXIP促进乳腺癌细胞迁移的过程受miR-520b的调控。
　　 本实验对HBXIP调节乳腺癌细胞迁移的机理进行了探索，其分子机制是：miR-520b靶向HBXIP的3’UTR，抑制HBXIP的翻译，从而调节乳腺癌细胞迁移。
　　 2．HBXIP蛋白纯化条件的探索
　　 HBXIP全长173个氨基酸，分子量约19 kDa，几乎表达于高等动物的各种组织中，但在肌肉组织和恶性肿瘤组织中高表达。HBXIP可以参与细胞凋亡、中心体复制、细胞迁移、细胞周期等过程，揭示HBXIP的蛋白晶体结构有助于进一步了解HBXIP在细胞生命活动中所发挥的作用。实验中，我们构建了含HBXIP基因全长522bp的原核表达载体pet-28a-HBXIP1和含其C端273bp的原核表达载体pet-28a-HBXIP2，利用亲和层析、分子筛层析、离子交换层析等方法，对His-HBXIP1及His-HBXIP2的纯化条件进行了初步探索。发现，His-HBXIP1经分子筛层析纯化后，吸收峰单一，但蛋白浓度较低；经离子交换层析纯化后，His-HBXIP1穿透明显，蛋白弥散分布。His-HBXIP2的纯化效果与His-HBXIP1情况类似。
　　 本实验对HBXIP的纯化条件进行了初步探索，发现His-HBXIP的分子筛层析纯化效果优于离子交换层析。