短期热量限制对老年大鼠肾脏衰老和急性肾损伤的保护作用

摘要

背景与目的：肾脏是伴随着衰老而出现明显形态和功能改变的重要器官之一，老年人群是慢性肾脏病和急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的高危人群。在模式生物及动物实验研究证实，热量限制(Calorie restriction，CR)是一种可维护健康并能延长寿命的安全有效措施。老年人肿瘤发生率高，顺铂作为一种被广泛应用的肿瘤化疗药物，其常见且十分严重的副作用是引起AKI。肾小管上皮细胞凋亡是顺铂导致AKI的主要发生机制之一。有实验研究表明长期CR可减少细胞凋亡，但是短期CR是否具有同样的保护作用尚不清楚。本实验通过对25月龄老年大鼠进行短期（8周）CR，观察对肾脏衰老相关指标的影响；然后建立顺铂诱导的急性肾小管上皮细胞凋亡的体内、体外实验模型，观察短期CR能否减少顺铂造成的肾小管上皮细胞凋亡，并探讨其中的可能机制。
　　 方法:1、对25月龄老年SD大鼠随机分为自由饮食组和短期（8周）热量限制组，于观察期间不同时间点测量大鼠体重、肾重、24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、胆固醇、甘油三脂、血清白蛋白及总蛋白变化，并通过Western blot检测衰老相关指标，包括能量代谢主控蛋白SIRT1，自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62、Polyubiquitin，以及重要信号通路蛋白mTOR在老年肾脏组织中的表达变化，同时对老年肾脏中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表达变化进行检测。
　　 2、应用顺铂（6mg/kg）腹腔注射建立体内顺铂诱导的急性肾小管损伤模型，以自由饮食老年大鼠为对照组，研究短期CR对老年大鼠急性肾小管损伤的调控作用。两组老年大鼠分别于注射后48h、72h收集大鼠血清及肾脏组织标本，通过分析肾功能指标和肾组织病理变化，比较CR组与对照组肾脏的损伤程度，并通过Western blot检测SIRT1及凋亡标志性蛋白Cleaved caspase-3在肾脏组织中的表达变化。同时，用100M的顺铂刺激人肾小管上皮细胞(HKC)在体外建立肾小管上皮细胞凋亡模型。细胞实验分为对照组(Con)和体外热量限制模拟组(CRs)，体外热量限制模拟组采用CR组大鼠灭活的血清培养。HKC细胞经无血清DMEM同步14～16h，分别以自由饮食和热量限制的大鼠血清培养6-8h后，再以10uM顺铂刺激24h，Western blot检测SIRT1与凋亡标志性蛋白Cleavedcaspase-3的表达变化。通过体内与体外实验共同探讨短期CR、SIRT1与Cleavedcaspase-3的相互关系，揭示短期CR是否对顺铂诱导的急性肾小管上皮细胞凋亡具有保护作用。
　　 结果.1、与3月龄青年大鼠比较，27月龄老年大鼠的肾功能水平下降，但血脂水平显著升高。与老年自由饮食组比较，短期CR组老年大鼠的体重、24h尿蛋白总量及血清甘油三酯明显降低(p<0.05)。短期CR组较自由饮食组老年大鼠肾脏组织中SIRT1和自噬相关蛋白LC3、Beclin l均升高，而p62、Polyubiquitin均下降，roTOR蛋白表达也下降(pl<0.05)。凋亡相关蛋白Bcl-2及Cleaved caspase-3均显著降低(p<0.05)，而Bax无显著变化。
　　 2、老年大鼠经腹腔注射顺铂72h后发生急性肾损伤，血清肌酐及尿素氮均有显著升高：肾组织病理学结果显示：肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性或颗粒样变性，肾小管上皮细胞出现凋亡表型一细胞核固缩，以及细胞脱落、坏死。而顺铂对短期CR大鼠引起的急性肾小管病理损伤均较对照组轻。利用Westernblot检测Cleaved caspase-3研究顺铂诱导急性肾损伤模型中细胞凋亡的发生情况。对照组大鼠肾组织中Cleaved caspase-3蛋白的表达呈上升趋势，在72h达到高峰；短期CR大鼠肾脏组织中Cleaved caspase-3表达也有增加，但48h和72h均显著低于对照组。同时利用Western blot方法检测了老年大鼠肾脏组织中SIRT1蛋白的表达变化，发现顺铂能降低肾脏组织中SIRT1的表达。体外实验与体内实验结果一致。通过CR组大鼠血清培养可显著提高HKC细胞SIRT1的表达，在顺铂刺激下HKC细胞Cleaved caspase-3的表达明显增高。但CR血清培养组与对照组HKC细胞Cleaved caspase-3的表达无显著差异。
　　 结论：老年大鼠肾组织中能量代谢主控蛋白SIRT1表达和自噬水平降低、而mTOR蛋白表达和基础凋亡水平增加。对老年大鼠短期CR可激活肾脏组织中SIRT1的表达，提高自噬水平，抑制mTOR蛋白的表达，改善老年大鼠的基础凋亡水平。短期CR可减轻顺铂诱导的急性肾小管损伤、抑制上皮细胞凋亡，此作用可能与SIRT1的表达无关。因此，本研究首次证实了短期CR可抑制肾脏衰老过程，对顺铂造成的急性肾损伤也具有一定的保护作用。