八氢番茄红素脱氢酶活性测定体系的相关研究

摘要

植物体内，类胡萝卜素可以吸收、传递光能，其合成一旦受阻，植物的光合作用、生长发育将不能顺利进行。八氢番茄红素和六氢番茄红素是类胡萝卜素合成途径中两种重要的无色类胡萝卜素，因此催化八氢番茄红素脱氢生成六氢番茄红素的关键酶--八氢番茄红素脱氢酶(PDS)成为酰胺类除草剂的作用靶标。近年来，针对该靶标设计合成了许多的目标化合物，本研究拟采用原核表达系统进行酶活分析，通过摸索底物八氢番茄红素的合成和八氢番茄红素脱氢酶的表达情况，以及酶活性的分析方法，建立一种稳定，快速，高效的适合高通量筛选该类除草剂的检测方法。
　　 本论文确定八氢番茄红素HPLC的条件为：C18柱，纯乙醇流动相，柱温为室温，流速为1mL/min，检测波长为286nm。探究了光对八氢番茄红素稳定性的影响，结果显示光源导致其氧化降解程度大小为：白炽灯>自然光。对于PDS酶的表达，成功转化获得了E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli RosettaTM2(DE3)pLvsS以及E.coli JM109三种PDS蛋白原核表达菌株，并进行了PDS蛋白原核表达的初步研究，包括菌体的培养时间、温度、诱导时间等，结果显示37℃下，菌体生长OD600为0.6-0.8时，加入IPTG终浓度为1mmol/L，28℃下表达4至5个小时是较适宜的表达条件；摸索了促进E.coli RosettaTM2(DE3)pLysS PDS蛋白可溶性表达的条件，包括菌体裂解方式和不同调节剂的添加，如蔗糖，NaCl，以促进可溶性PDS的表达。
　　 另外，本研究还初步建立了两种PDS酶活测定体系：体外酶活分析和体内酶活测定。分别进行了三种E.coli表达菌株中PDS酶活性的测定分析，得到了能同时合成底物八氢番茄红素和表达八氢番茄红素脱氢酶的E.coli JM109，为进行体内酶活测定提供了实验材料，研究结果为除草剂筛选系统的进一步建立提供了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 八氢番茄红素的相关研究

1.1.1 八氢番茄红素的生物合成

1.1.2 八氢番茄红素的结构特征、理化性质

1.1.3 八氢番茄红素的功能

1.1.4 八氢番茄红素的检测

第二节 八氢番茄红素脱氢酶的相关研究

1.2.1 八氢番茄红素脱氢酶蛋白组学的研究进展

1.2.2 八氢番茄红素脱氢酶的功能

1.2.3 八氢番茄红素脱氢酶的原核表达

第三节 PDS靶标酶除草剂的研究和应用前景

1.3.1 除草剂的概况、分类及设计依据

1.3.2 PDS靶标类除草剂的作用机理

1.3.3 PDS靶标类除草剂的生物筛选和应用前景

第四节 本研究的内容和意义

第二章 实验材料与实验方法

第一节 实验材料

2.1.1 实验所用菌株

2.1.2 实验所用质粒

2.1.3 实验所用仪器

2.1.4 实验所用试剂及配方

2.1.5 实验所用工具酶和分子生物学试剂

第二节 实验方法

2.2.1 八氢番茄红素的表达和提取

2.2.2 PDS蛋白表达菌株的获得及鉴定

2.2.3 PDS蛋白原核表达及鉴定

2.2.4 除草剂筛选系统中的酶活测定

第三章 结果与讨论

第一节 八氢番茄红素的检测

3.1.1 线性实验

3.1.2 HPLC检测条件的优化

3.1.3 八氢番茄红素最低检测浓度的确定

3.1.4 八氢番茄红素稳定性的研究

第二节 PDS蛋白原核表达的研究

3.2.1 PDS蛋白表达菌株的获得及鉴定

3.2.2 PDS蛋白的原核表达及可溶性表达的摸索

第三节 除草剂筛选体系的酶活测定

3.3.1 体外酶活测定

3.3.2 体内酶活测定

第四章 小结与展望

第五章 创新点

参考文献

致谢

个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果