大肠杆菌罕见单糖UDP-L-RhaNAc3NFo合成途径及糖基转移酶功能的鉴定

摘要

大肠杆菌是一种重要的条件致病菌，能引起腹泻甚至导致死亡。大肠杆菌的毒性往往和其O抗原悉悉相关。O抗原位于革兰氏阴性细菌脂多糖分子的最外层，一般由多个寡糖重复单位组成。O抗原具有高度多样性，并对细菌细胞膜功能的完整性非常重要。对O抗原合成途径的研究有利于揭示细菌的致病机理，也可为抗生素和疫苗等的研究和生产提供依据，从而使大肠杆菌引起的传染病得到更好的治愈。
　　 在大肠杆菌O抗原中已鉴定了十几种单糖的合成基因，本研究将对大肠杆菌中罕见单糖L-RhaNAc3NFo的合成途径以及糖基转移酶的功能进行鉴定。这不仅有助于加深我们对O抗原基因簇功能及其合成途径的理解，也可为实现糖的体外合成奠定基础。
　　 本研究根据已获得的O抗原结构以及O抗原基因簇序列，利用生物信息学的手段，在实验室前期工作基础上完成了进一步的预测。预测发现大肠杆菌G1059中的罕见单糖L-RhaNAc3NFo共由4个基因编码的蛋白合成，分别为orf4、orf5、orf6和orf7，并对蛋白的功能进行了初步的预测。另外本研究还预测了大肠杆菌G3198和G2805中负责半乳糖转移的糖基转移酶orf11和wbwC基因的功能。
　　 本研究利用T7原核表达系统构建了相关基因的重组质粒，并在E.coli BL21(DE3)中对目的蛋白进行了表达，确立了目的蛋白的最适表达条件，同时对Orf4、Orf5、Orf6和Orf7蛋白进行了纯化。随后建立了体外的酶促反应，并采用毛细管电泳和质谱的方法对酶促反应的产物进行了鉴定。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第一节 研究背景简介

1 大肠杆菌简介

2 革兰氏阴性细菌的O抗原

3 重要的糖类

4 重组蛋白质的表达与纯化

5 检测方法

第二节 研究目标、内容和创新性

1 研究目标

2 研究内容

3 创新性

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

1 菌株

2 质粒

3 引物

4 主要试剂

5 实验仪器

6 培养基及试剂配制

第二节 实验方法

1 生物信息学分析

2 菌株基因组DNA提取

3 聚合酶链式反应(PCR)

4 重组质粒的构建

5 感受态细胞的制备和转化

6 重组蛋白在E.coli-BL21(DE3)中的小量表达

7 重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量诱导表达及纯化

8 罕见单糖L-RhaNAc3NFo的体外酶促反应

9 糖基转移酶的体外酶促反应

10 反应产物的检测

第三章 结果与分析

第一节 大肠杆菌G1059中罕见单糖L-RhaNAc3NFo合成途径鉴定

1 大肠杆菌G1059的O抗原基因簇序列分析

2 大肠杆菌G1059的O抗原结构

3 单糖合成酶基因分析

4 大肠杆菌G1059中罕见单糖LIDP-L-RhaNAc3NFo合成路径的预测

5 重组质粒的克隆构建

6 目的蛋白的表达和纯化

7 体外酶活反应

第二节 大肠杆菌G2805、G3198中糖基转移酶活性的鉴定

1 大肠杆菌G2805和G3198的O抗原结构

2 大肠杆菌G3198的糖基转移酶基因

3 大肠杆菌G2805的0抗原基因簇序列分析

4 糖基转移酶基因重组质粒构建

5 目的蛋白的表达和纯化

6 体外酶促反应

第四章 总结与讨论

第一节 UDP-L-RhaNAc3NFo合成途径的鉴定

1 罕见单糖UDP-L-RhaNAc3NFo合成途径预测

2 目的基因的重组克隆构建及目的蛋白的表达纯化

3 体外酶促反应

第二节 半乳糖糖基转移酶功能的鉴定

1 生物信息学分析相关基因

2 目的基因的重组克隆构建及目的蛋白的表达

3 体外酶促反应

参考文献

致谢

个人简历