胚肾微环境诱导小鼠骨髓间充质干细胞向肾脏上皮细胞分化

摘要

背景与目的：肾小管损伤是急性肾损伤发生的重要环节，目前临床上缺乏有效的治疗手段。急性肾小管坏死后，用于组织修复重建的细胞其来源并不清楚。体内实验显示，在小鼠急性肾衰竭模型中，间充质干细胞(MSCs)能够分化为肾小管上皮细胞增强组织修复能力，但定植细胞的比例和分化效率不高。由于MSCs可被诱导分化为多种脏器的实质细胞，是否可诱导MSCs定向分化为肾小管上皮细胞从而更好地发挥其治疗效果？定向分化的方法和机制是其要解决的关键问题。
　　 骨形态发生蛋白7(Bmp7)作为转录生长因子(TGF-β)中的一员，在整个胚胎发育过程中广泛表达，对于肾脏的正常发育非常重要，在间充质.上皮细胞转分化(MET)过程中起着重要的调控作用。同时，有研究显示Bmp7在肾脏损伤后的修复重建方面有重要调控作用。可以有效阻止肾小管的萎缩并减轻间质纤维化的程度，减少上皮细胞凋亡等，促进肾脏功能的恢复。
　　 目前发现胚肾发育过程存在的微环境提供多种生长因子，某些为定向分化生长因子，利用胚肾的微环境，是否可将MSCs诱导成肾脏系细胞以及诱导机制如何，目前尚不清楚。
　　 本研究拟通过胚肾细胞解离/重聚共培养法和胚肾显微注射法，联合Bmp7的作用，由发育早期的胚肾为MSCs分化提供微环境，研究MSCs向肾脏系细胞分化。
　　 方法：(1)体外培养红色荧光蛋白(RFP)标记的小鼠MSCs(mMSC)，以骨形态发生蛋白7(Bmp7)进行处理，分为对照组与Bmp7转染组；(2)分别采用解离/重聚共培养法和显微注射技术，建立诱导mMSCs分化的胚肾微环境，利用RFP荧光示踪活体胚肾中的MSCs分布、生长情况；(3)行组织冰冻切片免疫荧光染色，共聚焦显微镜观察胚肾中mMSCs与原位胚肾细胞的相互作用方式及mMSCs中肾脏系细胞特异性分子的蛋白表达情况。
　　 结果：(1)经Bmp7预处理的mMSCs，mRNA水平未见间充质和上皮标志分子(Vimentin、Cadherin6、E-Cadherin)的表达变化；(2)解离/重聚共培养法诱导11d后，对照组与Bmp7转染组均可见mMSCs在该微环境中明显发生迁移，能够聚集在胚肾细胞外围；部分细胞整合到表达E-Cadherin的上皮细胞间，没有发生细胞融合；少量细胞可以表达上皮细胞标志物E-Cadherin；(3)在胚肾显微注射mMSCs后，胚肾生长状况良好，mMSCs散在分布于后肾组织中，持续表达RFP荧光标记蛋白；与对照组相比，胚肾中转染Bmp7组的mMSCs部分有上皮样变化，免疫荧光显示其表达上皮细胞标志物E-Cadherin，且能够与胚肾细胞共同参与肾脏小管的发育形成。
　　 结论：在早期胚肾微环境下，mMSC受诱导后可以发生迁移、聚集，并定向诱导分化为表达E-Cadherin的肾脏上皮细胞，与原位的胚肾细胞共同参与肾脏小管的发育形成；转染Bmp7对mMSCs的上皮分化起到促进作用。本研究可以为mMSCs向上皮细胞定向分化的机制提供一定的实验、理论基础。