葡萄细胞提取物的心肌保护和神经保护作用研究

摘要

据WHO统计报道，心脑血管疾病是目前严重威胁人类健康的头号杀手，2008年1730余万死于心血管疾病，占死亡比例的30％，推测到2030年，约2360万人将死于心血管疾病，它将仍是影响人类生存的最主要致死因素。同时随着人口老龄化的发展，神经退行性病变在人群中所占的比例也在逐渐增加，WHO报道现有接近3560万的痴呆症患者，预测到2030年这一数字将翻倍，达到6570万，到2050年将超过三倍达11540万。
　　 鉴于报道葡萄中含有的白藜芦醇、花青素等多酚类物质具有抗心脑疾病的潜力，本课题就悬浮培养的葡萄细胞的提取物在心肌保护和预防老年痴呆方面的作用展开了研究。
　　 首先对植物细胞培养技术获得的葡萄细胞进行了有效成分的提取分离，建立并优化了微波法针对葡萄细胞的高效提取工艺，即以20％乙醇作为提取溶剂，料液比1:5，微波输出功率设定600 W，提取最高温度75℃，微波提取2 min可高效提取葡萄细胞中的白藜芦醇苷；同时确定了提取物的质量控制标准，粗提物分别经乙酸乙酯萃取、D101大孔树脂纯化和硅胶柱纯化可获得白藜芦醇苷含量分别达30％，50％，80％以上的葡萄细胞提取物。其次，三种组分的葡萄细胞提取物分别针对H9c2和PC12两株细胞进行心肌保护和神经保护的活性筛选，结果显示葡萄细胞提取物VVE388在50μg/ml的较低浓度下对H2O2损伤的PC12细胞具有显著的保护作用。最后，就VVE388的神经保护机制展开了研究。结果显示，与对照组相比，以VVE388预处理的细胞组总SOD活力较损伤组提高19倍左右，GSH含量较损伤组提升31％±3.7％。总SOD活力和GSH含量均显著提高，提示VVE388可通过调控SOD活力和GSH的量来清除进入细胞内的过氧化物，抵抗H2O2产生的O2·-和·OH对细胞造成的损伤而发挥神经保护作用，同时ROS积累实验也证明了这一点，以VVE388预处理组的ROS积累量较H2O2损伤组显著降低了47.3％±6.7％。同时凋亡实验研究发现VVE388可降低H2O2损伤造成的PC12细胞凋亡的比例。本课题的研究为今后开展更深入的药理实验，开发具有临床预防、治疗意义的药物及新资源食品认证奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 立题依据及意义

1.1.1 立题依据

1.1.2 立题意义

1.2 葡萄多酚的研究概况

1.2.1 葡萄多酚在心肌保护方面的研究进展

1.2.2 白藜芦醇等二苯乙烯类化合物在神经保护方面的研究进展

1.3 本课题研究的目的、思路

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究思路

1.3.3 创新之处

第二章 葡萄细胞中有效成分的提取、纯化和分析

2.1 实验材料

2.1.1 主要仪器设备

2.1.2 主要试剂

2.1.3 细胞株

2.2 微波法提取工艺的建立

2.2.1 微波输出功率对葡萄细胞中PD提取率影响的单因素考察实验

2.2.2 微波提取时间对葡萄细胞中PD提取率影响的单因素考察实验

2.2.3 不同浓度乙醇对葡萄细胞中PD提取率影响的单因素考察实验

2.2.4 不同料液比对葡萄细胞中PD提取率影响的单因素考察实验

2.3 纯化方法

2.3.1 萃取法

2.3.2 D101大孔树脂柱纯化

2.3.3 硅胶柱纯化

2.4 HPLC法含量测定

2.4.1 色谱条件

2.4.2 线性关系考察

2.4.3 精密度实验

2.4.4 重复性实验

2.4.5 样品稳定性实验

2.4.6 加样回收率实验

2.5 葡萄细胞提取物的成分测试

2.5.1 总酚含量测定

2.5.2 花青素含量测定

2.5.3 FRAP法测定提取物抗氧化活性

2.6 实验结果

2.6.1 微波提取工艺考察结果

2.6.2 纯化结果

2.6.3 HPLC法含量测定结果

2.6.4 葡萄细胞提取物成分测试结果

第三章 葡萄细胞提取物心肌保护作用研究

3.1 材料

3.1.1 主要仪器设备

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要配置试剂

3.1.4 细胞株

3.2 方法

3.2.1 细胞培养

3.2.2 H2O2对H9c2细胞损伤作用

3.2.3 葡萄细胞提取物对H9c2的作用研究

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 葡萄细胞提取物神经保护作用研究

4.1 材料

4.1.1 主要仪器设备

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要配置试剂

4.1.4 细胞株

4.2 方法

4.2.1 细胞培养

4.2.2 H2O2对PC12细胞的损伤作用研究

4.2.3 葡萄细胞提取物对PC12的作用研究

4.2.4 GSH含量和SOD活力测定

4.2.5 ROS测定

4.2.6 PC12凋亡检测

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 结论

第六章 展望

参考文献

致谢

个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果