钌(Ⅱ)多吡啶配合物对多重耐药菌MRSA光动力抗菌作用的研究

摘要

目的：研究新型光敏剂钌(Ⅱ)多吡啶配合物Ru1、Ru2和Ru3对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的光动力(Photodynamic therapy，PDT)抗菌作用，为探索PDT抗多重耐药菌提供实验依据。
　　 方法：
　　 (1)用PBS配制不同浓度(5μM、10μM、15μM、20μM和25μM)的三种光敏剂溶液，分别测定不同浓度的三种光敏剂的吸收光谱，根据吸收光谱选定三种光敏剂的PDT治疗激发光波长。
　　 (2)三种光敏剂对MRSA的PDT抗菌作用的研究。实验分PDT组、单纯光敏剂组、单纯光照组和空白对照组。PDT组：不同浓度的光敏剂与菌液(光敏剂终浓度为50μM、25μM、10μM、2.5μM、0.25μM、0.025μM，细菌终浓度为108CFU/mL)孵育30min后，以激发波长532nm激光照射Ru1、4.57nm激光照射Ru2和Ru3，照射时间10min(功率密度40mW/cm2)。单纯光敏剂组：光敏剂与菌液浓度同PDT组，孵育30min，不予照光。单纯光照组：菌液浓度同PDT组，不予光敏剂孵育，激光照射剂量同PDT组。空白对照组：菌液浓度同PDT组，不予光敏剂，不予照光。处理后30min内以稀释平板法测定细菌存活浓度，通过与空白对照组比较，分析PDT组各浓度点的抗菌效果，并对三种光敏剂的PDT抗菌效率进行比较。
　　 (3)PDT抗菌作用位点的初步研究：选择浓度为2.5μM的光敏剂Ru3对MRSA进行PDT处理(激光照射参数同前)，分别在处理后即刻、10min、30min用3％戊二醛将菌液固定，以磷钨酸进行负染色后，在透射电镜下观察细菌形态学改变。以2.5μM的Ru3为光敏剂，对对数生长期的MRSA菌液进行PDT处理(激光照射参数同前)后，提取基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
　　 结果：
　　 (1)三种光敏剂的最大吸收峰均在紫外波段。在可见光区Ru1的吸收峰在490nm和560nm，Ru2的吸收峰在405nm和465nm，Ru3的吸收峰在410nm和435nm，根据三种光敏剂在457nm和532nm波长处的摩尔消光系数的比较，Ru1选用532nm为激发波长，Ru2和Ru3则以457nm为激发波长。
　　 (2)单纯457nm或532nm激光照射均不影响细菌的活性，三种光敏剂的单纯光敏剂组对细菌活性也无影响。Ru2和Ru3的PDT抗菌作用较Ru1强，前两种光敏剂浓度为2.5μM时即能达到有效杀菌(使细菌存活浓度降低3Log10以上)，而Ru1在浓度为10μM时才能达到有效杀菌。
　　 (3)电镜观察发现细菌膜结构(包括细胞壁和细胞膜)破坏严重，形成碎片，细胞内容物外溢，染色体暴露。PDT处理后随着时间延长，各视野内膜结构仍然完整的细菌数量递减。电泳结果显示PDT组DNA电泳条带变淡。
　　 结论：
　　 (1)三种钌(Ⅱ)多吡啶配合物光敏剂介导的PDT作用能有效杀伤MRSA，其抗菌作用Ru3≈Ru2>Ru1。
　　 (2)细菌的膜结构可能是光敏剂钌(Ⅱ)多吡啶配合物介导的PDT作用的主要位点。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第二章 三种钌(Ⅱ)多吡啶配合物吸收光谱特性

第一节 实验目的

第二节 材料与方法

2.2.1 材料与仪器

2.2.2 实验方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 小结

第三章 三种钌(Ⅱ)多吡啶配合物对金黄色葡萄球菌的PDT杀伤效应研究

第一节 引言

第二节 材料与方法

3.2.1 材料与仪器

3.2.2 实验方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 小结

第四章 钌(Ⅱ)多吡啶配合物对MRSA的PDT作用位点初步研究

第一节 实验目的

第二节 材料与方法

4.2.1 材料与仪器

4.2.2 实验方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 小结

第五章 结论与展望

参考文献

致谢

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