EV71聚合酶上的位点在VPg尿苷化和基因组复制中的作用

摘要

肠道病毒71(Enterovirus71，EV71)属于小核糖核酸病毒科，是引起儿童手足口病的主要病原体。小核糖核酸病毒的复制是由VPg的尿苷化起始的，此过程需要依赖于RNA的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRp）并且是后续病毒负链RNA合成所必须的。尿苷化过程需要VPg、模板、UTP、聚合酶和/或其前体形式等多种组分。然而，现有报道表明小核糖核酸病毒VPg的尿苷化机制各不相同，尤其是RdRp与VPg的结合位点。本论文中，我们鉴定出位于EV71RdRp上的311-317位氨基酸，这些位点在VPg尿苷化和EV71复制过程中发挥关键作用。我们发现所选取的七个位点中有四个位点(I311、T313、F314和I317)是复制所必须的。将这四个位点用甘氨酸(Gly)取代后不影响RdRp的活性，表明这些位点是通过非酶催化机制发挥作用的。生化和细胞实验表明这四个位点通过与VPg的结合影响RNA合成的起始。因此，我们的结果为EV71RdRp上VPg的结合位点提供了直接证据。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 EV71病毒概述

1．1．1 手足口病疫情

1．1．2 引起手足口病的病毒

1．1．3 EV71病毒复制与VPg尿苷化过程

1．1．4 EV71抗病毒药物研究现状

第二节 选题意义

第二章 EV71聚合酶、突变体及VPg载体的构建

第一节 实验仪器及材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂与培养基

2．1．3 实验材料

第二节 实验方法

2．2．1 3D基因扩增

2．2．2 3D突变体基因扩增

2．2．3 VPg基因的扩增

2．2．4 PCR产物回收

2．2．5 DNA与载体双酶切并回收

2．2．6 酶切后的DNA与载体连接

2．2．7 连接产物转化感受态细胞

2．2．8 阳性克隆鉴定

2．2．9 重组质粒转化感受态细胞

第三节 结果与讨论

2．3．1 3D及突变体表达载体的构建

2．3．2 VPg表达载体的构建

第三章 EV71聚合酶、突变体及VPg蛋白的表达纯化

第一节 实验仪器及材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验试剂与培养基

第二节 3D聚合酶、突变体及VPg蛋白表达纯化

3．2．1 3D及突变体蛋白的表达纯化

3．2．2 GST-VPg融合蛋白的表达纯化

第三节 结果与讨论

3．3．1 3D及突变体蛋白的表达

3．3．2 GST-VPg蛋白的表达

第四章 体外实验

第一节 实验仪器及材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 主要试剂

第二节 3D及其突变体蛋白与GST-VPg蛋白的相互作用

4．2．1 3D及其突变体蛋白与GST-VPg蛋白的pull down

4．2．2 体外VPg尿苷化

4．2．3 体外RNA延伸

4．3．4 突变对3D聚合状态的影响

第三节 结果与讨论

4．3．1 突变对3D与VPg相互作用的影响

4．3．2 突变对EV71 VPg尿苷化的影响

4．3．3 突变对EV71 RNA延伸的影响

4．3．4 突变对3D聚集状态的影响

第五章 细胞实验

第一节 实验仪器及试剂

5．1．1 实验仪器

5．1．2 主要试剂

5．1．3 实验材料

第二节 感染性克隆构建

5．2．1 3D及突变体质粒提取

5．2．2 克隆构建

5．2．3 质粒的大量提取

5．2．4 质粒的线性化

第三节 体外转录

5．3．1 体外转录

第四节 转染细胞

5．4．1 细胞转染

5．4．2 48hp．t的细胞IFA实验

5．4．3 单层法测病毒滴度

第五节 结果与讨论

5．5．1 IFA实验结果

5．5．2 病毒滴度测定

第六章 全文结论与展望

参考文献

致谢

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果