HIV-1 CRF07 B’/C gp41 HR2结构特征初探

摘要

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是获得性免疫综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病原体。有关HIV复制、病毒与宿主相互作用和治疗干预等是目前生物学研究的热点。虽然人们发现了控制HIV生活周期中各个过程的抑制剂，但是一旦人体感染HIV，即使在药物帮助下，感染者仍无法完全清除体内病毒，最终可能发病致死。HIV包膜蛋白由gp120和gp41构成，HIV依靠gp120和gp41吸附到宿主细胞膜上，介导病毒与细胞膜的融合。gp41在病毒颗粒表面暴露的比较少，不容易被中和抗体所识别，但是由于gp41比gp120在序列保守性高及糖基化程度低，是诱导产生广谱中和抗体疫苗研发的理想靶标。鉴于此，大量关于HIV gp41晶体结构的研究正在进行。HIV特异性序列的选择是在病毒变异需求和宿主免疫系统压力的共同作用下产生的结果。虽然跨膜蛋白gp41相对来说比较保守，但也存在一定程度的变异。因此通过改变原始序列及空间构像所产生的适应性不仅对逃脱抵抗病毒的中和抗体十分重要，而且对病毒复制和感染也是至关重要的。HIV-1 CRF07 B'/C gp41是中国西北地区的主要流行株，本实验室前期研究，获得其晶体结构。本文通过将HIV-1 CRF07 B'/C重组型gp41序列与B亚型相比，发现17个突变氨基酸位点，且大多数位于六螺旋束的表面。
　　 本研究主要内容包括：⑴通过将这些位点分别向B亚型gp41中对应位点氨基酸进行突变，我们发现大多数突变不影响蛋白质的稳定性。结合本实验室关于突变对病毒融合能力影响实验结果，得出结论，突变引起的融合能力的改变不是由蛋白的稳定性变化引起的。⑵通过序列比对，大多数突变集中于HR2区的N末端高突变区，推测该高突变位点对病毒感染和适应性十分重要。通过将这些高突变位点突变成能破坏螺旋结构的脯氨酸，我们发现gp41稳定性被破坏，结合本实验室融合实验结果N640P突变保持与野生型相似的融合能力，我们得出结论，存在于HR2 N端部分的中断对该蛋白的功能并非总是致死的。⑶结合融合实验结果提出gp41融合前模型假说，在该模型中，在HR1和HR2的中间都是折断的形式，即HR1和HR2中间都有柔韧性区域，并非是刚性的连续的螺旋结构。同时证明了协调性的Loop向螺旋的转变对于病毒融合来说是必不可少的。⑷通过对HIV-1 CRF07 B'/C与典型B亚型的gp41序列进行比对，研究其突变对蛋白稳定的影响，发现HR2高突变位点对于HIV介导的细胞-细胞融合非常重要，并在病毒入侵期间包膜构象变化中扮演重要角色。本文的研究为提出了新的关于HIV膜融合机制构象变化模型，同时也为研究详细的膜融合过程，进而为抑制HIV感染的相关研究提供新的思路。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 人类免疫缺陷病毒

1．1．1 人类免疫缺陷病毒简介

1．1．2 HIV病毒颗粒结构

1．1．3 病毒基因组

1．1．4 Env蛋白及功能

1．1．5 Coied-Coil结构

1．1．6 α-螺旋结构

1．1．7 HIV生活周期

第二节 HIV流行株简介

1．2．1 HIV流行株起源

1．2．2 HIV变异原因

1．2．3 HIV-1中国流行株

第三节 病毒膜融合过程概述

1．3．1 病毒膜融合步骤

1．3．2 相关病毒膜融合简介

1．3．3 HIV-1 Env介导的膜融合简介

第四节 本研究目的与意义

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 质粒

2．1．3 主要实验仪器

2．1．6 主要溶液及配方

第二节 实验方法

2．2．1 聚合酶链式反应

2．2．2 质粒构建

2．2．3 重组蛋白诱导表达与纯化

2．2．4 蛋白质浓度的测定

2．2．5 蛋白质纯度检测

2．2．6 蛋白质圆二色测定

第三章 结果

第一节 前期基础

第二节 CRF07向B亚型gp41的突变研究

3．2．1 与典型B亚型gp41进行序列比对，找出相应突变氨基酸

3．2．2 HIV-1 CRF07 B’／C gp41点突变原核质粒的构建

3．2．3 gp41突变体蛋白的诱导表达及纯化

3．2．4 gp41突变体蛋白浓度及纯度检测

3．2．5 gp41突变体蛋白圆二色(CD)测定

第三节 CRF07 B’／C gp41 HR2高突变区点突变研究

3．3．1 HR2中间的高突变群突变分析

3．3．2 原核点突变质粒的构建

3．3．3 gp41突变体蛋白的诱导表达及纯化

3．3．4 gp41突变体蛋白的浓度、纯度检测

3．3．5 gp41突变体蛋白圆二色(CD)测定

第四章 讨论

第一节 CRF07向B亚型gp41点突变对蛋白稳定性影响

第二节 CRF07 B’／C gp41 HR2高突变区点突变研究

4．2．1 CRF07 B’／C gp41 HR2高突变区点突变对蛋白稳定影响

4．2．2 融合前模型假说的提出

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表的论文与研究成果