乙肝病毒X蛋白结合蛋白（Hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）是一个分子量为19kDa的蛋白，因其可与乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus x protein，HBx)的C端特异性结合而得名，HBXIP在脊椎动物中非常保守，是细胞组成型蛋白。HBXIP在肿瘤细胞的增殖、有丝分裂、中心体动态和细胞周期进展中发挥重要作用。HBXIP还参与mTORC1复合体形成，参与mTORC1信号通路。我们实验室前期研究发现HBXIP具有促进乳腺癌细胞增殖和迁移的作用，但是其调节机制尚不清楚。Skp2是一种潜在的癌蛋白，其表达对于细胞进入S期是必须的，并且在多种肿瘤中高表达，参与DNA复制，细胞周期，凋亡，侵袭，转移等过程。本研究探讨HBXIP和Skp2的关系及其在肿瘤发生过程中的作用及分子机制，主要研究结果如下: 第一部分:HBXIP促进乳腺癌的增殖作用 我们应用组织芯片和免疫组化方法在49例乳腺癌组织中检测了HBXIP和Skp2蛋白表达的相关性，结果显示HBXIP和Skp2的表达呈显著的正相关。随后我们又用时时定量PCR方法检测了30例新鲜乳腺癌组织中HBXIP和Skp2的mRNA的表达水平，得到了相似的结果。为了研究HBXIP对Skp2表达的影响，我们应用免疫印记实验和RT-PCR实验检测了4种乳腺癌细胞系中HBXIP和Skp2的蛋白和mRNA的表达水平。结果显示在MCF-7和SK-BR-3细胞中，HBXIP以剂量依赖方式上调Skp2蛋白和mRNA的表达，而在LM-MCF-7和MCF-7-HBXIP细胞中干扰HBXIP，Skp2蛋白和mRNA的表达可以剂量依赖的方式下调。我们进一步检测了转染了HBXIP后乳腺癌细胞中Skp2下游蛋白的表达，结果显示Skp2下游蛋白的表达趋势与Skp2一致。为了研究HBXIP上调Skp2的分子机制，我们利用荧光素酶报告基因实验检测了HBXIP对Skp2启动子活性的影响。结果显示HBXIP在乳腺癌MCF-7细胞中可以剂量依赖的方式增强Skp2启动子的活性;而在LM-MCF-7和MCF-7-HBXIP细胞中干扰HBXIP，则可以剂量依赖的方式下调Skp2启动子的活性。免疫组化结果显示HBXIP可定位于细胞核中，表明HBXIP可能发挥核功能。随机将Skp2启动子区域分为3个片段，分别是-776/-567，-640/-443，-464/-250。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验显示HBXIP可以结合Skp2启动子-640/-443片段。我们通过在线启动子分析软件预测发现Skp2启动子-640/-443区域内存在潜在的转录因子(E2F1)结合位点。免疫共沉淀实验(Co-IP)证实HBXIP和Skp2蛋白可以相互结合。电泳迁移率(EMSA)实验显示HBXIP可能通过转录因子E2F1与Skp2启动子结合。荧光素酶报告基因结果显示E2F1突变位点后HBXIP上调Skp2启动子活性的能力下降。再次证实HBXIP通过与转录因子E2F1位点结合并激活Skp2的启动子区域。另一方面，HBXIP在乳腺癌细胞中可以调节转录因子E2F1的蛋白和mRNA的表达水平，提示HBXIP可能通过调节转录因子E2F1的表达进而调控Skp2的表达。进一步的MTT实验和平板克隆形成实验证实HBXIP促进乳腺癌细胞的增殖是通过调节Skp2实现的，而流式细胞术结果表明HBXIP促进乳腺癌细胞的增殖是通过调节细胞进入S期的实现的，此过程中Skp2发挥重要作用。动物成瘤实验表明，HBXIP通过Skp2促进乳腺癌肿瘤的生长。综上所述，HBXIP通过转录因子E2F1增强Skp2启动子活性，进而促进乳腺癌细胞的增殖。 第二部分:HBXIP促进卵巢癌的迁移作用 我们应用组织芯片和免疫组化方法在80例卵巢癌组织中检测了HBXIP和Skp2蛋白表达的相关性，结果显示HBXIP和Skp2的表达呈显著的正相关。为了研究卵巢癌中HBXIP的表达对Skp2的影响，我们应用免疫印记实验和RT-PCR实验检测了2种卵巢癌细胞系中HBXIP和Skp2的蛋白和mRNA的表达水平。结果显示在2种卵巢癌SKOV3和CAOV3细胞中，HBXIP以剂量依赖方式上调Skp2的蛋白和mRNA的表达。随后我们利用荧光素酶报告基因实验检测了HBXIP对Skp2启动子活性的影响，结果显示HBXIP在卵巢癌SKOV3和CAOV3细胞中可以剂量依赖的方式增强Skp2启动子的活性。卵巢癌病理组织免疫组化结果显示HBXIP可定位于细胞核中，表明HBXIP可能发挥核功能。我们随机将Skp2启动子区域分为3个片段，分别是-776/-567，-640/-443，-464/-250。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验显示HBXIP可以结合Skp2启动子-640/-443区域。通过在线启动子分析软件预测发现Skp2启动子-640/-443区域内包含潜在的转录因子Sp1结合位点，随后我们合成了Sp1结合位点突变的Skp2启动子，荧光素酶报告基因结果显示在卵巢癌SKOV3和CAOV3细胞中HBXIP上调Skp2突变启动子活性的能力下降。再次证实HBXIP通过转录因子Sp1位点结合到Skp2的启动子区域。进一步的细胞划痕实验证实HBXIP促进卵巢癌细胞的迁移是通过调节Skp2实现的。综上所述，HBXIP通过转录因子Sp1增强Skp2启动子活性，进而促进卵巢癌细胞的迁移。 综上所述，本研究在分子、细胞、动物和临床标本等多个层面对HBXIP和Skp2与肿瘤的关系进行了深入细致的研究。我们的研究结果显示:HBXIP是一种新的癌蛋白，可以通过多种途径影响多种肿瘤细胞的增殖和迁移的功能。上述研究可以为深入揭示HBXIP的致病机理提供新的实验依据，并进一步丰富HBXIP的致癌的分子机制，为肿瘤的预防和治疗提供新的理论价值。
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