“超级细菌”NDM-1抑制剂筛选与体外抗菌活性测定

摘要

2010年印度，欧洲，巴基斯坦，美国，中国等多国出现一种新型广谱耐药细菌—超级细菌NDM-1，其引起传染病爆发，临床上缺乏有效治疗抗生素，而给人类的生命健康带来重大威胁，它的出现也把人类滥用抗生素造成细菌耐药性这个问题推向风口浪尖。超级细菌NDM-1可以编码新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-actamase1，NDM-1)，此酶能够分解青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等临床上使用的大部分抗生素。它引发疫情大爆发主要是因为编码酶的基因位于游离于细菌基因的质粒(140kb)上，致使基因blaNDM-1在细菌间快速传播。
　　 新德里金属β-内酰胺酶晶体结构的解析阐述了酶的三维结构和作用方式，在确立其三维结构的基础上，研究针对其三维结构的药物发现，以及针对此靶点的高通量药物筛选和对筛选得到的有效抑制剂进行体外抗菌活性实验得到有抑制作用的化合物，对于先导化合物的发现和改造提供有力的实验方向和数据。
　　 本实验构建新德里金属β-内酰胺酶三个不同截短（Gly42-Arg270、Gly47-Arg270、Gly29-Arg270）的重组表达载体，经过亲和层析、离子交换柱和凝胶过滤层析等纯化方法纯化获得95％纯度目的蛋白NLP1和NLP2;通过高通量药物筛选获得40种有抑制活性的化合物，其中IC50最高值可达1.51±0.21μM，并对其中7种化合物进行了体外抗菌活性实验，L-12表现出的体外抗菌效果最好，MIC达到16μg/mL，说明在蛋白水平有良好抑制作用的化合物，在细胞水平并没有表现出同样效果的抑制作用，推测可能是由于化合物的水溶性，以及化合物不能有效进入细胞等方式引起的。
　　 本文从结构水平、蛋白水平、细胞水平三方面进行了针对新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的抑制剂探究，这为如何针对此靶点的抑制剂结构改造以及如何改造获得进入细胞体内发挥作用的化合物提供了方向;全面系统提供了针对金属β-内酰胺酶抑制剂研究的原理和方法;也对解决由金属β-内酰胺酶引起细菌耐药性问题有重大意义。

目录

声明

摘要

文章符号说明

第一章 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1研究背景介绍

第一节 “超级细菌”NDM-1

1．1．1 “超级细菌”NDM-1爆发

1．1．2 细菌耐药性以及“超级细菌”NDM-1的耐药性

第二节 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1研究背景介绍

1．2．1 β-内酰胺类抗生素

1．2．2 β-内酰胺酶(β-lactamase)生物学性质及分类

1．2．3 NDM-1结构描述及酶的活性位点分析

第三节 金属β-内酰胺酶抑制剂研究现状

1．3．1 头孢菌素类金属β-内酰胺酶抑制剂

1．3．2 青霉素类金属β-内酰胺酶抑制剂

1．3．3 氨基酸类金属β-内酰胺酶抑制剂

第四节 新德里金属β-内酰胺酶的研究意义

第二章 药物筛选简介

第一节 高通量药物筛选

第二节 细胞体外抗菌活性实验

2．2．1 药物体外抗菌实验

2．2．2 体外抑菌实验

2．2．3 体外杀菌实验

2．2．4 联合抗菌实验

2．2．5 体外抗菌实验的影响因素

2．2．6 针对NDM-1靶点筛选得到的抑制剂进行体外抑菌实验

第三章 实验材料与方法

第一节 实验材料和实验仪器

3．1．1 实验菌种及载体

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

第二节 实验方法及步骤

3．2．1 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1蛋白获得

3．2．3 NDM-1新德里金属β-内酰胺酶抑制剂的筛选

3．2．4 NDM-1新德里金属β-内酰胺酶抑制剂体外抗菌活性实验

第四章 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1实验结果与分析

第一节 NDM-1新德里金属β-内酰胺酶蛋白获得实验结果

4．1．1 NDM-1分子克隆和重组子构建

4．1．2 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1蛋白纯化实验结果

4．1．3 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1蛋白结晶实验结果

第二节 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1抑制剂筛选实验结果

4．2．1 NDM-1抑制剂筛选体系

4．2．2 NDM-1抑制剂筛选实验结果

第三节 新德里金属β-内酰胺酶NDM-1体外抗菌活性实验结果

4．3．1 实验菌株的构建

4．3．2 阳性实验菌株的检验

4．3．3 已知抗生素体外抗菌活性实验实验结果

4．3．4 抑制活性化合物体外抗菌活性实验实验结果

第五章 实验讨论与总结

参考文献

致谢

附录

附录A NDM-1新德里金属β-内酰胺酶基因序列

附录B NDM-1新德里金属β-内酰胺酶氨基酸序列

个人简介