人类干扰素调节因子7重组蛋白的纯化和抗体制备

摘要

干扰素（IFNs）是宿主抵御病毒感染的最早期免疫应答的重要参与者。其在引发抗病毒反应和细胞生长调控以及免疫激活等方面起着重要的作用，其中IFN家族中的I型IFN又是人类先天和后天免疫应答的主要组成因子，其诱导的宿主细胞抗病毒应答是宿主抗病毒感染的主要防御机制。而干扰素调节因子7（IRF-7）作为一种参与I型干扰素诱导合成和活性调控的关键性调控因子，在抗病毒感染方面有着重要的地位。此外IRF-7还可直接作用于病毒的启动子以达到抑制病毒激活的目的。
　　 本文以原核表达质粒pET28a为载体，构建了一系列的IRF-7重组质粒，分别是pET28a-IRF-7A(146-246 aa)、pET28a-IRF-7A(146-311 aa)、pET28a-IRF-7A(373-467aa)、pET28a-IRF-7A(274-467 aa)、pET28a-IRF-7A(146-503 aa)和pET28a-IRF-7A(146-227 and323-503 aa)，并将它们分别转化E.coli BL21(DE3)以备诱导表达，并对其中含pET28a-IRF-7A(274-467 aa)、pET28a-IRF-7A(146-503aa)质粒的克隆进行了蛋白诱导表达条件的优化，最终确定了两者的最终诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG，28℃，诱导时长为4h。以此诱导条件对蛋白IRF-7A(274-467 aa)和IRF-7A(146-503aa)进行了大量诱导表达，并利用Ni亲和层析的方法对它们进行了纯化。分别以纯化的蛋白IRF-7A(274-467 aa)和IRF-7A(146-503 aa)为抗原免疫新西兰雌兔，使其产生多克隆抗体。制备的抗IRF-7A(274-467 aa)和IRF-7A(146-503aa)的多克隆抗体已通过免疫印迹来检测，实验表明其不仅可以特异性识别抗原并且有较高的效价(血清稀释度1∶128000)。本文制备的多克隆抗体，为后续检测IRF-7蛋白的表达研究积累了实验材料。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 人类干扰素调节因子7是宿主免疫系统的重要调节因子

1．1．1 人类干扰素调节因子7的发现

1．1．2 人类干扰素调节因子7的结构

1．1．3 人类干扰素调节因子7的调控

1．1．4 人类干扰素调节因子7对干扰素合成的影响

第二节 干扰素调节因子7参与宿主抵御人类8型疱疹病毒的感染

1．2．1 人类8型疱疹病毒的发现

1．2．2 人类8型疱疹病毒的感染状态

1．2．3 人类8型疱疹病毒的致病机制

1．2．4 干扰素调节因子7对人类8型疱疹病毒感染的抑制

第三节 本文的研究意义

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 质粒

2．1．3 引物

2．1．4 试剂

2．1．5 计算机软件

2．1．6 实验动物

第二节 实验方法

2．2．1 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

2．2．2 分子克隆

2．2．3 重组蛋白的表达和纯化

2．2．4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．2．5 多克隆抗体的制备

2．2．6 蛋白免疫印迹法检测抗体

第三章 结果

第一节 质粒的构建

3．1．1 pET-28a-IRF-7A(146-246 aa)的构建

3．1．2 pET-28a-IRF-7A(146-311 aa)的构建

3．1．3 pET-28a-IRF-7A(373-467 aa)的构建

3．1．4 pET-28a-IRF-7A(274-467 aa)的构建

3．1．5 pET-28a-IRF-7A(146-503 aa)的构建

3．1．6 pET-28a-IRF-7A(146-227 and 323-503 aa)的构建

第二节 重组蛋白的表达与纯化

3．2．1 构建质粒中目的蛋白的表达

3．2．2 蛋白IRF-7A(274-467 aa)的表达和纯化

3．2．3 蛋白IRF-7A(146-503 aa)的表达和纯化

第三节 多克隆抗体的制备与检测

3．3．1 IRF-7A(274-467 aa)抗体的检测

3．3．2 IRF-7A(146-503 aa)抗体灵敏度的检测

第四章 讨论

第一节 重组蛋白的表达和纯化

4．1．1 IRF-7A(274-467 aa)重组蛋白的表达与纯化

4．1．2 IRF-7A(146-503 aa)重组蛋白的表达与纯化

第二节 使用抗IRF-7A(274-467 aa)、IRF-7A(146-503 aa)的抗体检测重组蛋白

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历