CaMBP-10参与植物抗生物和非生物胁迫作用与机制的研究

摘要

植物非特异性转脂蛋白(nsLTPs)是一类广泛存在于高等植物中的碱性小分子蛋白家族。许多研究表明，生物和非生物胁迫能够诱导nsLTPs过表达，并且nsLTPs能不同程度的诱导植物系统性获得抗性的产生。Ca2+-CaM信号转导系统也参与了植物体内众多调节功能。本实验室曾在中国大白菜中分离得到了一种分子量约10kDa的钙调素结合蛋白CaMBP-10（简称BP-10）。通过核苷酸序列和氨基酸序列比对和脂结合活性等理化性质分析，已经确定BP-10是植物非特异性转脂蛋白家族的新成员。本论文以白菜和拟南芥为材料，研究了BP-10在体内参与植物抗生物和非生物胁迫的作用，探讨CaM参与这种功能的调节，并通过蛋白质组学的方法初步了解这种作用的机制。
　　 首先，通过高盐、ABA和SA处理与RT-PCR、蛋白表达分析，对白菜体内的BP-10功能进行了研究。实验结果显示，BP-10的表达出现了不同程度的上调，初步说明了其在体内参与了对环境的防御功能。其次，为了进一步确定BP-10是转脂蛋白家族成员并能参与植物的抗生物和非生物胁迫作用，分别对转BP-10和转BP-10的CaM结合缺失突变体（简称4ABP-10）的转基因拟南芥进行了抗性研究。通过真菌孢子、盐和旱的胁迫，我们对转基因拟南芥的叶片侵染情况、种子发芽率、幼苗根长和成苗表型进行了分析。结果显示转BP-10的转基因拟南芥在全部胁迫过程中的抗性都要明显好于转4ABP-10的转基因拟南芥和野生型拟南芥，而转4ABP-10的转基因拟南芥与野生型拟南芥的生长状态没有太大差别。这说明BP-10确实在植物体内抗性防御中起到重要作用，并且这种作用是受钙调素调节的。再次，为进一步探讨BP-10的作用机制，我们通过化学交联法在蛋白质组学层面寻找和BP-10相互作用的蛋白，并且与其它蛋白质组学的方法相互验证，进而为其在BP-10信号转导途径中的作用机制提供线索。

目录

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摘要

第一章 引言

第一节 植物非特异性转脂蛋白

第二节 Ca2+／CaM信号转导系统

第三节 CaMBP10是一种新的非特异性转脂蛋白

第四节 选题依据

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料与试剂

2．1．1 实验材料与试剂

2．1．2 实验仪器

第二节 实验方法

2．2．1 重组BP-10的表达与纯化

2．2．2 凝胶覆盖法分析和鉴定重组BP-10和融合蛋白的CaM结合能力

2．2．3 胶体金标记BP-10单克隆抗体的制备及免疫印记分析

2．2．4 白菜的培养及非生物胁迫的处理

2．2．5 白菜总蛋白的提取和诱导蛋白的RT-PCR分析

2．2．6 拟南芥的培养

2．2．7 Southern blot检测转基因拟南芥中外源序列的拷贝数

2．2．8 转基因拟南芥对生物和非生物胁迫的抗性分析

2．2．9 化学交联法锚定与融合蛋白His6·3C·BP10相互作用的蛋白

第三章 实验结果

第一节 重组BP-10表达、纯化与免疫印记分析

3．1．1 重组BP-10的表达和纯化

3．1．2 免疫印记分析重组BP-10和融合蛋白的抗体结合活性

第二节 非生物胁迫对白菜CaMBP10表达的影响

3．2．1 RNA水平上高盐、ABA和SA胁迫对CaMBP10表达的影响

3．2．2 蛋白质水平上盐胁迫对CaMBP10表达的影响

第三节 Southern blot检测转基因拟南芥中外源序列的拷贝数

3．3．1 CTAB法提取植物基因组DNA和定量

3．3．2 酶切时间的摸索和酶切结果

3．3．3 探针的制备和检测

3．3．4 Southern blot

第四节 转基因拟南芥对生物和非生物胁迫的抗性分析

3．4．1 转基因拟南芥对生物胁迫的实验结果

3．4．2 转基因拟南芥对非生物胁迫的实验结果

第五节 化学交联法锚定与BP-10相互作用的蛋白

3．5．1 白菜蛋白用量的摸索

3．5．2 NaCl对融合蛋白与白菜蛋白结合的影响

3．5．3 交联时间和交联剂戊二醛量的摸索

第四章 讨论

第一节 非特异性转脂蛋白BP-10作用的体内研究

4．1．1 转脂蛋白BP-10参与白菜体内的抗逆反应

4．1．2 转脂蛋白BP-10参与转基因拟南芥抗生物和非生物胁迫作用

第二节 非特异性转脂蛋白BP-10与钙调素可能的作用机制

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历