KLF5对正常和肿瘤上皮细胞上皮间质转化抑制作用的研究

摘要

KLF5（Krüppel-like factor5）作为一个基础转录因子，调控着很多生理和病理过程。一些研究KLF5生物学功能的文献或是生物信息学的分析虽然暗示了KLF5和上皮间质转化(EMT)这一重要的细胞生物学过程密切相关，但是，KLF5能否直接调节EMT，如何调控EMT，怎样关联于现有的EMT信号通路，以及是否在肿瘤EMT及其相关过程中发挥作用等很多重要的科学问题尚待回答。在本研究中，我们围绕正常和肿瘤上皮细胞中KLF5是否以及如何调控上皮间质转化的核心针对以上问题进行了逐一探索。首先，用TGF-β和EGF联合诱导正常上皮细胞发生EMT，或是用TGF-β在前列腺肿瘤上皮细胞中诱导EMT都造成了KLF5表达的下调。而不论是在正常上皮细胞还是肿瘤上皮细胞中敲减KLF5都能破坏上皮表型诱导EMT，主要体现在细胞形态变长，迁移（和浸润）的能力增强，表征上皮状态的分子标志物如E-cadherin和ZO-1表达下调而表征间质状态的分子标志物如FN1和Vimentin等表达上调，以及E-cadherin和肌动蛋白纤维膜定位的改变。从机制上讲，我们根据芯片筛选，用生物化学的手段鉴定了KLF5可以通过结合在miR-200启动区的GC盒上激活miR-200表达。并且在功能上，miR-200的过表达可以恢复无论是KLF5敲减还是TGF-β和EGF诱导带来EMT。而过表达KLF5也可以恢复无论是正常上皮细胞还是肿瘤上皮细胞中诱导的EMT。在前列腺癌中，KLF5影响与EMT密切相关的肿瘤干性。DU145细胞的裸鼠成瘤实验提供了KLF5在前列腺癌中抑制EMT抑制肿瘤干性的进一步证据。PB-Cre介导的Pten和Klf5双敲小鼠中的结果，为敲除Klf5减少miR-200表达促进EMT提供了体内证据。患者乳腺病理样本中对KLF5和miR-200表达进行的相关性分析为KLF5-miR-200轴的存在提供了人源样本的证据。总而言之，在正常和肿瘤上皮中，KLF5通过转录激活miR-200家族表达维持上皮表型抑制诱导的EMT过程，为上皮细胞响应TGF-β信号发生EMT提供了新机制。KLF5-miR-200轴通过调节EMT-MET过程，可能对细胞迁移，细胞干性，iPSCs，肿瘤的发生和转移等多种生理病理过程产生深远影响。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 引言

第一节 上皮间质转化(EMT)

1．1．1 上皮细胞可塑性和上皮间质转化

1．1．2 正常上皮细胞EMT

1．1．3 肿瘤上皮细胞EMT

1．1．4 介导EMT的信号通路与相关的分子标志物

第二节 Krüppel-like factor 5(KLF5)

1．2．1 KLF5基因和蛋白

1．2．2 KLF5的表达

1．2．3 KLF5调控的生物学过程

1．2．4 KLF5的蛋白修饰

1．2．5 胚胎发育中的KLF5

第三节 转化生长因子β(TGF-β)

1．3．1 TGF-β与EMT

1．3．2 TGF-β抑制细胞增殖

1．3．3 抑制增殖和促进EMT的功能转变

第四节 MicroRNA-200家族

1．4．1 miR-200和EMT

1．4．2 miR-200的转录本和调控因子

1．4．3 miR-200与TGF-β

1．4．4 miR-200和iPSCs

第五节 肿瘤干细胞

1．5．1 前列腺肿瘤干细胞与三种克隆

1．5．2 肿瘤干细胞和EMT的关系

第六节 研究假说与要解决的关键问题

1．6．1 研究假说

1．6．2 要解决的关键问题

第二章 材料与方法

第一节 实验材料、试剂及主要仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

第二节 实验方法

2．2．1 质粒构建

2．2．2 细胞培养与转染

2．2．3 虫荧光素酶报告系统(Luciferase reporter assay)

2．2．4 慢病毒与逆转录病毒包装与感染

2．2．5 RNA提取，mRNA和miRNA的表达检测

2．2．6 Western Blotting

2．2．7 细胞免疫荧光染色

2．2．8 小鼠饲养与前列腺组织收集

2．2．9 石蜡切片

2．2．10 组织免疫荧光染色

2．2．11 裸鼠成瘤和肿瘤细胞分离

2．2．12 Transwell法检测细胞迁移和浸润

2．2．13 Oligonucleotide-pulldown检测

2．2．14 染色质免疫沉淀(ChIP)

2．2．15 前列腺微球体实验(Prostasphere)

2．2．16 克隆检测实验(Clonal assay)

2．2．17 结果统计分析

第三章 结果

第一节 KLF5在TGF-β诱导的EMT过程中表达下调

3．1．1 KLF5在TGF-β和EGF诱导的正常上皮细胞EMT过程中表达下调

3．1．2 KLF5在TGF-β诱导的肿瘤上皮细胞EMT过程中表达下调

3．1．3 蛋白降解是诱导EMT过程中KLF5表达下调的潜在原因

第二节 敲减KLF5促进正常和肿瘤上皮细胞向间质细胞转化

3．2．1 敲减KLF5促进正常上皮细胞的EMT

3．2．2 敲减KLF5促进肿瘤上皮细胞的EMT

第三节 KLF5通过调节miR-200家族调节EMT过程

3．3．1 KLF5影响参与EMT过程的miRNAs

3．3．2 KLF5正调控miR-200a／b／c的表达

3．3．3 KLF5通过结合miR-200家族启动子中的GC富含区调节其转录

3．3．4 过表达miR-200抑制TGF-β和EGF处理及KLF5敲减诱导的EMT

第四节 正常和肿瘤上皮细胞中过表达KLF5抑制EMT过程的诱导

3．4．1 过表达KLF5上调miR-200抑制TGF-β／EGF诱导的HaCaT细胞EMT

3．4．2 过表达KLF5在前列腺细胞系中抑制TGF-β诱导EMT

第五节 KLF5影响与EMT相关的前列腺肿瘤干性

3．5．1 敲减KLF5抑制前列腺肿瘤干性

3．5．2 过表达KLF5抑制前列腺肿瘤干性

第六节 在植入和自发小鼠肿瘤模型中的KLF5与EMT

3．6．1 DU 145肿瘤外植体模型中过表达KLF5抑制EMT和肿瘤干性

3．6．2 Pten敲除背景下，敲除Klf5下调miR-200表达促进EMT

第七节 KLF5和miR-200在乳腺癌病理样本中的表达相关性分析

第四章 讨论

第一节 KLF5通过转录激活miR-200表达维持上皮表型

第二节 KLF5-miR-200轴的表达下调是诱导EMT必要的

第三节 可能存在多种与KLF5协同调控miR-200的转录因子

第四节 KLF5-miR-200轴可能调节细胞干性

第五节 KLF5对EMT调节可能具有基质依赖性

第六节 KLF5调节EMT的可能的其他机制

第七节 前列腺癌中KLF5与EMT和肿瘤干性

第五章 结论

第一节 结论

第二节 展望

参考文献

致谢

附录

个人简历、在学期间发表的论文与研究成果