pfm基因对铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的影响

摘要

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)为一种常见的能够生存于多种自然生境和动植物组织中革兰氏阴性细菌。它是临床最普遍的引发院内严重获得性感染的条件致病菌，常引发急性或慢性感染，如烧伤伤口感染、下呼吸道感染、泌尿道感染以及医院获得性肺炎等。能够产生生物被膜的粘液型菌株可以定植在呼吸系统表面，引发肺囊性纤维化(CF)和弥漫性泛支气管炎等。它能够成功感染宿主细胞主要归功于它产生并分泌的一系列毒力因子，其中Ⅲ型分泌系统能够通过其针状结构将四种毒力因子直接注射至宿主细胞而引起宿主细胞的凋亡，是一种重要的毒力形成机制，因此对于Ⅲ型分泌系统相关作用机制的研究具有重要的科学意义和临床意义。
　　本文的出发菌株为铜绿假单胞菌临床分离株PA68、实验室前期构建所得pfmMu转座子插入突变株I69，提取了野生型PA68和pfm突变株I69的RNA，进行基因表达谱(microarray)分析。结果显示，在突变株I69中，很多Ⅲ型分泌系统相关基因表达水平都有不同程度的降低。为此，以模式菌株PAO1为背景，敲除pfm基因得到基因缺失株PAO1Δpfm进行进一步研究。利用启动子-lacZ融合子的β-半乳糖苷酶活性测定法测定野生型和缺失株的启动活性差异，构建效应蛋白ExoS、ExoT的启动子区域融合质粒PDN19lacΩ-PexoS、PDN19lacΩ-PexoT，β-半乳糖苷酶活性测定结果表明PAO1Δpfm中的PexoS、 PexoT的启动活性明显低于野生型，说明由于pfm基因的缺失，Ⅲ型分泌系统的效应蛋白ExoS、ExoT的表达受到了影响。ExoS作为Ⅲ型分泌系统的一个重要效应蛋白，它的表达量可以作为Ⅲ型分泌系统整体翻译表达的一种表征，SDS-PAGE、Western blot结果表明，无论是在菌体内还是分泌到菌体外环境，PAO1Δpfm中ExoS的含量均低于野生型，而基因回补株pfmC中则基本回复野生型的表达水平。提取野生型PAO1和缺陷型PAO1Δpfm的RNA，经反转录后进行Real-time qPCR，检测野生型和缺失株中Ⅲ型分泌系统重要基因exoS、exoT、exoY、pscJ、pscC、pcrV、popB及群体密度感应系统(QS)重要基因lasR、lasI、rhlR、rhlI的表达水平差异，结果表明相比于野生型，缺失株中Ⅲ型分泌系统基因表达有较显著的下降，而群体密度感应系统基因表达水平则有所升高。前期文献结果表明群体密度感应系统可以负调控Ⅲ型分泌系统，因此通过影响群体密度感应系统，可能是pfm间接影响Ⅲ型分泌系统的原因之一。另外，酵母双杂交实验证明蛋白PFM通过与FAD结合而与电子传递黄素蛋白ETF相互作用，因此通过影响能量代谢也可能是pfm影响Ⅲ型分泌系统的原因之一。
　　本研究通过实验证明pfm基因可以影响铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的表达，因此pfm有潜力作为抑制Ⅲ型分泌系统的一个药物靶点基因，从而降低铜绿假单胞菌的致病性。对于实验室和临床研究Ⅲ型分泌系统的作用机制和铜绿假单胞菌的致病性具有一定的科研意义和参考价值。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 铜绿假单胞菌与毒力因子

1．1．1 铜绿假单胞菌生物学特征

1．1．2 铜绿假单胞菌的毒力因子

1．1．3 铜绿假单胞菌毒力调控机制

第二节 铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统与表达调控

1．2．1 铜绿假单胞菌的分泌系统概况

1．2．2 铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统

1．2．3 铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的调控机制

1．2．4 铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统引发的病理反应

第三节 pfm基因研究概述

第四节 本文研究意义及目的

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究目的

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料及仪器设备

2．1．1 实验菌株与质粒

2．1．2 酶制剂及化学试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 基因测序及引物合成

2．1．5 生物信息学分析软件

2．1．6 PCR引物及扩增程序

第二节 实验方法

2．2．1 培养基与试剂的配制

2．2．2 PA68和169 Affymetrix GeneChip表达谱芯片分析

2．2．3 铜绿假单胞菌基因组DNA的提取

2．2．4 高纯度质粒大量提取(用于低拷贝质粒提取)

2．2．5 质粒小量提取

2．2．6 琼脂糖凝胶的目的DNA片段的回收

2．2．7 酶切产物及PCR产物的纯化

2．2．8 E．coli电转化感受态细胞的制备

2．2．9 铜绿假单胞菌电转化感受态细胞的制备及转化

2．2．10 酿酒酵母AH109电转化感受态细胞的制备与转化

2．2．11 酶切、连接及阳性克隆的筛选

2．2．12 PAO1与PAO1△pfm在5mmol／L EGTA诱导条件下生长曲线测定

2．2．13 缺陷株PAO1△pfm表型分析

2．2．14 Ⅲ型分泌系统效应蛋白启动子的β-半乳糖苷酶活性测定

2．2．15 SDS-PAGE和Western blot检测Ⅲ型分泌系统效应蛋白ExoS

2．2．16 Real-time qPCR检测PAO1与PAO1△pfmⅢ型分泌系统表达差异

2．2．17 pfm点突变

2．2．18 酵母双杂交检测

第三章 实验结果及讨论

第一节 Microarray analysis

3．1．1 PA68和169表达谱芯片分析结果

第二节 PAO1△pfm生长曲线及表型测定

3．2．1 PAO1与PAO1△pfm在5mmol／L EGTA诱导条件下生长曲线测定

3．2．2 PAO1与PAO1△pfm表型对比

第三节 pfm影响Ⅲ型分泌系统

3．3．1 缺失株PAO1△pfm基因回补株PAO1pfmC的构建

3．3．2 pDN19lacΩ-PexoS和pDN19lacΩ-PexoT融合子β-半乳糖苷酶活性测定

3．3．3 SDS-PAGE和Western blot检测ExoS

3．3．4 Real-time qPCR检测PAO1与PAO1△pfmⅢ型分泌系统表达的差异

第四节 pfm与ETF作用机制初探

3．4．1 pfm点突变质粒及酵母双杂交质粒的构建

3．4．2 酵母双杂交检测

第四章 结论

附录

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果