病毒感染中JNK信号对杀伤性T细胞的调节作用

摘要

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一员，参与调控细胞存活、增殖、分化、凋亡等多种细胞功能。哺乳动物细胞中JNK有JNK1、JNK2、JNK3三型，其中JNK3仅限于在脑、心脏和睾丸中表达，而不表达于造血干细胞。JNK1和JNK2在组织中广泛表达，可被细胞外的细胞因子、应激刺激等多种因素激活。JNK信号通路是一个由上游激酶、下游底物以及支架蛋白等各组分构成的复杂调控网络，在将细胞外刺激信号转导至细胞核内转录因子的过程中起重要作用，同时又存在着与细胞内其它信号通路的相互联系，对胞外的各种信号做出特异、有效的应答，从而对细胞的多个生命过程进行调控。JNK对细胞的调控作用在不同的细胞类型中表现不同，且JNK1和JNK2对细胞的调控具有各自不同的作用。
　　在由抗原刺激引起的活化和表达之前，JNK在T细胞和B细胞中的表达水平非常低。JNK信号通路可通过免疫细胞表面的抗原受体以及多种细胞因子受体等识别外界刺激而活化，进而参与调控免疫细胞的多种生命活动和免疫应答。有关JNK信号通路对辅助性T细胞（CD4+T细胞）增殖、分化等过程调控作用的研究比较广泛，也较为清楚。而有关JNK信号通路对杀伤性T细胞(CD8+T细胞)调控作用的研究还比较有限，特别是JNK1、JNK2特异性地调控CTL的不同功能的具体分子机制还不清楚。
　　杀伤性T细胞(cytolytic T lymphocyte，CTL)是机体抗病毒感染免疫过程中至关重要的效应细胞。病毒感染后，初始CD8+T细胞识别抗原而活化，经历迅速、大量的克隆增殖后，分化为具有MHCⅠ类分子限制性和抗原特异性的效应CTL。CTL主要通过两种机制发挥抗病毒效应:一方面CTL通过穿孔素-颗粒酶介导的细胞毒作用对病毒感染细胞直接进行杀伤;另一方面CTL分泌效应细胞因子，如IFN-γ，对病毒的复制和扩散进行控制。
　　鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV)与人类天花病毒(variola virus，VARV)同属于痘病毒科正痘病毒属，与天花病毒具有高度的同源性。ECTV感染具有种属特异性，感染小鼠后可引发与人类感染天花病毒后极为相似的病理过程及宿主抗病毒反应，是研究病毒致病机理及宿主抗病毒反应的良好模型。ECTV感染后，小鼠的预后及转归与机体的免疫应答密切相关。小鼠的康复需要巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等固有免疫细胞以及CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞等适应性免疫细胞和干扰素(IFNs)等细胞因子的联合作用，其中CTL介导的细胞免疫应答是控制和清除ECTV最为重要的因素。
　　本论文采用模拟ECTV自然感染JNK敲除(JNK1-/-、JNK2-/-)小鼠模型，探索JNK信号通路在CTL抗病毒感染免疫应答中的调节作用。结果显示，JNK1、JNK2缺失后，小鼠对ECTV的抵抗及清除能力明显下降。JNK1缺失后CD8+T细胞增殖能力下降，而JNK2缺失后CD8+T细胞增殖能力增强，但JNK1、JNK2缺失均未对CD8+T细胞活化后诱导的凋亡(AICD)产生明显影响。说明JNK1、JNK2缺失导致的细胞增殖差异不是影响小鼠病毒清除能力下降的直接原因。进一步的实验发现，JNK1、JNK2缺失后CD8+T细胞的活化水平下降，针对ECTV免疫主导表位B8R的病毒特异性CTL的数量与野生型小鼠相比显著下降;JNK1-/-和JNK2-/-小鼠CTL产生颗粒酶B及IFN-γ的能力显著下降;而且JNK1、JNK2缺失后，CTL特异性杀伤能力（细胞毒作用）表现为延迟并降低。本论文的实验结果说明，JNK缺失导致CTL的活化和效应功能受损是小鼠抵抗及清除病毒能力下降的主要原因，提示JNK通过调控CTL应答在机体抗病毒免疫过程中发挥重要的调节作用，并且不同型别的JNK对CTL的调控作用不同。本论文的研究结果，对于深入了解免疫应答反应，尤其是CTL应答的调控机制具有重要价值，同时可为感染性疾病帮肿瘤的临床免疫治疗提供理论参考和潜在工具。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 前言

第一节 JNK信号通路

1．1．1 JNK信号通路概述

1．1．2 JNK信号通路对细胞生命过程的调控作用

1．1．3 JNK在疾病中的作用

第二节 杀伤性T淋巴细胞

1．2．1 免疫及抗病毒免疫

1．2．2 杀伤性T淋巴细胞概述

1．2．3 CTL抗病毒免疫应答

1．2．4 CTL抗病毒感染机制

第三节 JNK信号通路对免疫系统的作用

1．3．1 JNK信号通路对固有免疫的调节

1．3．2 JNK信号对B细胞发育和功能的调节

1．3．3 JNK信号对T细胞发育和功能的调节

第四节 鼠痘病毒及感染模型

1．4．1 天花

1．4．2 痘病毒分类

1．4．3 鼠痘病毒及感染模型

第五节 研究背景和意义

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 细胞和病毒

2．1．2 实验动物

2．1．3 实验仪器设备与耗材试剂

第二节 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 病毒的培养及滴度测定

2．2．3 JNK基因敲除仔鼠的繁育及基因型鉴定

2．2．4 JNK-／-．OT-I仔鼠的繁育及基因型鉴定

2．2．5 小鼠感染模型的建立及组织病毒滴度的测定

2．2．6 流式细胞术(FACS)检测

2．2．7 CD8+T细胞体内增殖检测

2．2．8 CTL凋亡检测

2．2．9 CTL杀伤实验(细胞毒作用)

2．2．10 细胞因子的ELISA检测

2．2．11 免疫磁珠分选CD8+T细胞

2．2．12 组织中蛋白表达的Western blotting检测

第三章 结果与分析

第一节 小鼠基因型鉴定

3．1．1 JNK敲除小鼠基因型鉴定

3．1．2 OT-I转基因小鼠的鉴定

第二节 CD8+T细胞中JNK的表达及活性

第三节 JNK缺失对小鼠病毒清除的影响

3．3．1 JNK缺失对小鼠生存率的影响

3．3．2 JNK缺失对小鼠体内病毒清除的影响

3．3．3 机体免疫功能是决定体内病毒数量的主因

第四节 JNK缺失对外周淋巴细胞数量及CTL增殖的影响

3．4．1 ECTV感染后各基因型小鼠外周淋巴细胞数量的变化

3．4．2 ECTV感染后各基因型小鼠的CTL增殖

第五节 JNK缺失对CTL活化的影响

3．5．1 ECTV感染后各基因型小鼠的特异性CTL数量

3．5．2 JNK缺失对CD8+T细胞活化的影响

第六节 JNK缺失对CTL效应功能的影响

3．6．1 JNK缺失对CTL细胞毒作用的影响

3．6．2 JNK缺失对CTL产生颗粒酶及细胞因子的影响

第七节 JNK缺失对CTL凋亡的影响

第八节 JNK缺失对免疫调节作用的影响

第四章 讨论

第一节 JNK缺失可导致抗病毒能力下降

第二节 JNK对外周CTL数量的影响

第三节 JNK对CTL活化和功能的影响

第四节 JNK对免疫调节的影响

第五节 后续研究内容

结论

参考文献

致谢

个人简历