间充质干细胞介导乳腺癌治疗的分子影像学研究

摘要

近年来，越来越多的影像模式应用于肿瘤的诊断与治疗，分子影像作为一种非侵袭性的检测手段，能够在细胞以及分子水平上实时监测活体状态下的病理生理进程从而为肿瘤的细胞治疗提供了一种更加有效的评价方式。
　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，它能够迁移到肿瘤组织影响肿瘤的发生和发展，但其在肿瘤微环境中的具体作用尚未完全阐明。同时由于MSCs具有对肿瘤组织的趋向性，使其能够使其成为一类良好的载体系统应用于肿瘤的治疗。将MSCs与组织工程学方法结合起来，使其携带治疗性的药物或分子可扩大其在肿瘤治疗领域的运用。通过这种方式，肿瘤细胞不仅能被有选择性的杀伤并且还能有效地克服肿瘤细胞对传统药物产生的抗化疗作用。
　　在本课题中，我们应用人脐带来源的间充质干细胞(human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)研究其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响。同时运用分子影像技术实时监测细胞的动态过程，这为间充质干细胞介导的肿瘤的治疗提供了一种良好的评价方式。我们将hUC-MSC和MDA-MB-231细胞分别感染了三融合报告基因和双融合报告基因系统。双融合报告基因编码萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)和增强的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)，而三融合报告基因编码海肾荧光素酶（renilla luciferase，Rluc）、红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)和单纯孢疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus truncated thymidine kinase，HSV-ttk）。RFP和GFP的表达分别应用于hUC-MSC和MDA-MB-231细胞转染后的体外分选，同时自杀基因HSV-ttk可以应用于基因治疗，由于Rluc和Fluc的成像底物不同，这为同时检测hUC-MSCs和MDA-MB-231在体内的分布以及肿瘤的发展提供了可能。我们将携带三融合基因的hUC-MSCs(hUC-MSC-TF)移植入已建立的原位乳腺癌模型中，利用分子影像的方法实时监测了肿瘤的发展以及hUC-MSC-TF的存活情况。通过三个周期hUC-MSC-TF的原位移植，我们发现肿瘤的生长得到了明显的抑制，并且这种抑制作用在给予自杀基因HSV-ttk的底物更昔洛韦(ganciclovir, GCV)的条件下有所增强。为了进一步研究hUC-MSCs的抗肿瘤作用机理，我们应用近红外荧光成像技术对活体情况下肿瘤的血管新生以及其凋亡情况进行了分析。我们发现移植的hUC-MSCs在一定程度上能够抑制肿瘤的血管新生并且诱导肿瘤细胞凋亡情况的产生。
　　结论:移植的人脐带来源的间充质干细胞能够通过诱导肿瘤细胞的死亡以及下调肿瘤组织的血管新生来抑制乳腺的生长。同时分子影像在示踪细胞的呈递以及实时监测肿瘤对细胞治疗的应答发挥了极其重要的作用，从而为将来疾病的治疗提供了一种强有力的监测手段。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 分子影像学技术

1．1．1 光学成像

1．1．2 核磁共振成像

1．1．3 核素显像

第二节 间充质干细胞与肿瘤

1．2．1 间充质干细胞

1．2．2 间充质干细胞对肿瘤的促进作用

1．2．3 间充质干细胞对肿瘤的抑制作用

第三节 间充质干细胞作为细胞载体在肿瘤治疗方面的应用

1．3．1 间充质干细胞的肿瘤趋向性

1．3．2 间充质干细胞在肿瘤治疗方面发挥的作用

第四节 自杀基因治疗系统

1．4．1 自杀基因治疗

1．4．2 自杀基因治疗系统的旁观者效应

1．4．3 自杀基因载体以及在肿瘤中的应用

第五节 本课题的目的及科研假设

第二章 实验材料与试剂

第一节 实验材料

第二节 实验试剂

第三节 主要实验仪器

第三章 实验方法与统计

第一节 实验方法

3．1．1 细胞培养

3．1．2 质粒的提取

3．1．3 稳定细胞系的建立

3．1．4 细胞发光强度的鉴定

3．1．5 乳腺癌原位小鼠模型的建立

3．1．6 活体成像实验

3．1．7 免疫荧光染色

3．1．8 细胞条件培养基的收集

3．1．9 细胞活力实验

3．1．10 “旁观者效应”检测

3．1．11 Western Blot assay

3．1．12 流式细胞术检测细胞凋亡实验

3．1．13 细胞共培养实验

3．1．14 细胞总RNA的提取以及反转

3．1．15 Transwell检测间充质干细胞吸引内皮细胞实验

3．1．16 Real-time PCR

3．1．17 TUNEL细胞凋亡检测

第二节 统计方法

第四章 实验结果与分析

第一节 报告基因系统对细胞进行标记

4．1．1 报告基因系统对乳腺癌细胞的标记

4．1．2 报告基因系统对间充质干细胞的标记

第二节 间充质干细胞对乳腺癌生长的影响

4．2．1 原位乳腺癌移植模型的建立

4．2．2 移植的间充质干细胞对肿瘤生长具有抑制作用

4．2．3 移植的间充质干细胞在体内存活情况的检测

第三节 间充质干细胞对乳腺癌血管新生以及凋亡的研究

4．3．1 间充质干细胞能够明显减弱肿瘤的血管新生

4．3．2 间充质千细胞促进了肿瘤细胞凋亡情况的发生

第四节 表达自杀基因的间充干细胞对乳腺癌杀伤情况的研究

4．4．1 更昔洛韦(GCV)对表达自杀基因的间充质干细胞的杀伤作用

4．4．2 间充质干细胞对乳腺癌细胞“旁观者效应”的测定

第五节 间充质干细胞在体外对乳腺癌细胞生长的影响

4．5．1 间充质干细胞并不显著影响乳腺癌细胞的增殖

4．5．2 间充质干细胞对乳腺癌细胞周期蛋白表达水平的影响

4．5．3 间充质干细胞对乳腺癌细胞凋亡情况的检测

第六节 间充质干细胞体外对乳腺癌细胞血管相关分子的调控

4．6．1 间充质干细胞下调了乳腺癌细胞中血管相关分子的表达

4．6．2 间充质干细胞能够明显抑制对内皮细胞的招募

第五章 讨论

第六章 研究结论及主要创新点

第一节 研究结论

第二节 主要创新点

参考文献

致谢

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