原型泡沫病毒PFV反式激活因子Bel1核定位机制相关研究

摘要

泡沫病毒（foamy virus，FV）基因组均编码非结构蛋白Tas(transactivator ofspumavirus，Tas)。Tas蛋白是泡沫病毒的反式激活因子，在病毒基因表达调控中至关重要，为病毒复制所必需，此蛋白在原型泡沫病毒(prototype foamy virus，PFV)中又名Bel1（between env and LTR，Bel1）。前人研究表明，PFV Bel1含有核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，但对其NLS的具体序列、类型，不同研究组的结果存在明显差异。He和Venkatesh等认为Bel1核定位必需的最短氨基酸序列为209-226/211-225 aa;然而，Chang和Lee等研究认为其核定位信号为双分型，由两部分碱性氨基酸序列199-200 aa和211-223aa组成。
　　本文首先对不同研究组之间的分歧结果进行分析。通过定点突变并利用间接免疫荧光实验观察Bel1亚细胞分布，发现残基R221R222R223突变后会使Bel1改变亚细胞定位，由核定位转为胞浆定位;而R199H200则不然，突变后的Bel1仍定位于细胞核。表明残基R221R222R223对于Bel1核定位的作用十分关键，而残基R199H200并不涉及Bel1的核定位。这说明Bel1的核定位信号并非由两部分碱性氨基酸残基组成，即并非双分型。此外，尽管R199H200突变并不影响Bel1的核定位，但是这一突变却使Bel1丧失了反式激活PFV启动子的活性。随后的凝胶阻滞实验结果表明，残基R199H200对于Bel1直接结合病毒启动子DNA十分重要。在病毒感染性克隆中定点突变实验结果表明，Bel1中R199H200突变相比R221R222R223突变对PFV复制的影响更为显著。
　　为明确PFV Bel1核定位信号的具体序列及类型，我们进行进一步研究。首先利用EGFP-GST融合表达体系，插入Bel1截短片段，通过免疫荧光观察其亚细胞分布，精确确定Bel1的核定位信号序列为215pRQKRPR221;之后的定点突变实验表明残基K218、R219和R221为Bel1核定位所必需;结合生物信息学分析结果，确证Bel1核定位信号属于单分型。
　　明确Bel1核定位信号的具体序列后，本文利用体内GST-Pulldown、体外入核等手段探究了介导Bel1进入细胞核的核输入蛋白组分。通过体内GST-Pulldown实验，发现野生型Bel1不能与β核输入蛋白KPNB1相互作用，暗示Bel1可能采用经典的入核途径进入细胞核;发现α核输入蛋白KPNA1、KPNA2、KPNA6和KPNA7均能与野生型Bel1相结合，而只有KPNA1、KPNA6和KPNA7能够与截短体215-223发生相互作用，这表明KPNA1、KPNA6和KPNA7很可能是介导Bel1进入细胞核的适配体分子。进一步体外入核实验显示，分别加入KPNA1、KPNA6或KPNA7并辅以其他必需的入核因子均使Bel1定位于细胞核，最终确定介导Bel1入核的适配体分子为KPNA1、KPNA6和KPNA7。
　　综上所述，本文精确定位Bel1的核定位信号序列为215pRQKRPR221，明确其类型为单分型;同时确定KPNA1、KPNA6和KPNA7是介导Bel1入核的适配体分子。此外，本文确定了残基R199H200在Bel1反式激活PFV启动子中的关键作用，并解析其分子机制，即涉及Bel1直接结合LTR和IP启动子DNA。这些结果为正确划分Bel1蛋白结构域提供了新的实验数据，为进一步探明泡沫病毒调控蛋白的入核机制提供详实的实验结果，是深入研究PFV复制周期各个环节分子机制的重要参考。

目录

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摘要

图表清单

缩略语

第一章 引言

第一节 泡沫病毒概况

1．1．1 泡沫病毒的分类学地位

1．1．2 泡沫病毒的生物学特征

1．1．3 泡沫病毒的生活周期

第二节 泡沫病毒的转录调控因子Tas

1．2．1 泡沫病毒的基因表达调控

1．2．2 泡沫病毒的转录调控因子Tas

第三节 核定位信号介导的入核途径

1．3．1 核定位信号概述

1．3．2 核输入蛋白概述

1．3．3 经典入核途径概述

1．3．4 病毒及其蛋白的入核途径概述

第四节 本研究的目的及意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 细胞

2．1．3 质粒

2．1．4 抗生素

2．1．5 主要试剂

第二节 实验方法

2．2．1 基因工程

2．2．2 原核蛋白表达与纯化

2．2．3 抗血清制备与效价检测

2．2．4 细胞相关实验

2．2．5 免疫印迹(western blotting)

2．2．6 体内GST-Pull down

2．2．7 萤火虫荧光素酶活性测定(luciferase assay)

2．2．8 免疫荧光分析(immunofluorescence assay，IFA)

2．2．9 凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)

2．2．10 病毒制备与感染

2．2．11 RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)

2．2．12 反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)

2．2．13 体外入核实验(In vitro nuclear import assay)

2．2．14 统计学分析

第三章 结果与分析

第一节 残基R199H200不涉及Bel1的核定位

3．1．1 建立核定位信号研究体系

3．1．2 残基R199H200不涉及Bel1的核定位

第二节 精细定位Bel1核定位信号

3．2．1 Bel1核定位信号序列为215PRQKRPR221

3．2．2 Bel1核定位信号为单分型

第三节 Bel1借助KPNA1、KPNA6、KPNA7进入细胞核

3．3．1 筛选与Bel1相互作用的核输入蛋白

3．3．2 筛选与Bel1核定位信号相互作用的核输入蛋白

3．3．3 Bel1借助KPNA1、KPNA6、KPNA7进入细胞核

3．3．4 Knockdown相关KPNAs对于Bel1亚细胞定位的影响

3．3．5 解析KPNA7与Bel1相互作用结构域

第四节 Bel1残基R199H200对于PFV正常复制至关重要

3．4．1 残基R199H200为Bel1直接结合启动子DNA所必需

3．4．2 Bel1中残基R199H200突变将使PFV无法复制

第四章 讨论

第一节 Bel1核定位信号序列为215PRQKRPR221

第二节 Bel1借助KPNA1、KPNA6和KPNA7进入细胞核

第三节 残基R199H200为Bel1直接结合启动子DNA所必需

第五章 结论与展望

第一节 结论

第二节 展望

参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表论文