基于脱氧核酶的金属离子传感器及基于上转换发光纳米晶体的生物传感器设计

摘要

本论文的工作分为脱氧核酶型重金属离子传感器的设计和稀土上转换发光材料的合成及其生物检测应用两个部分。
　　Ⅰ脱氧核酶在重金属离子传感器方面的应用。
　　脱氧核酶是通过体外筛选技术得到的具有酶活性的小分子单链DNA，与天然酶相比，脱氧核酶具有稳定、价廉、易于合成和修饰及易于储存等特点，而且脱氧核酶对特定的金属离子显示了高度的特异性识别，其酶活性与特定金属离子的浓度密切相关，这些特点使其在金属离子检测中的应用备受关注。
　　(1)本章中将Pb2+DNAzyme中所使用的底物链与酶链用两个胞嘧啶碱基(C)进行连接，成为一条寡核苷酸链，并在其5’-端和3’-端分别标记以荧光基团和猝灭基团。在该寡核苷酸链形成的分子内二倍体结构当中，荧光基团与猝灭基团紧密接触，从而保证了高荧光猝灭效率，极大地降低了检测体系的背景信号，提高了信噪比。同时该检测体系可以对pb2+的加入作出快速响应，在30秒内检测体系的荧光信号即可达到稳定，从而可以实现Pb2+的快速检测。利用该方法进行Pb2+的定量检测，检测限可以达到3.1nM，远远低于欧盟对于饮用水中Pb2+的浓度要求(72 nM)。在这一方法中，单一寡核苷酸探针链形成的分子内二倍体结构不仅保证了检测体系具有较低的背景荧光，其良好的稳定性也极大地增加了该传感器对温度变化及离子强度变化的耐受能力。实验结果表明，在500 mM NaCl的存在下，该分子内二倍体结构的解链温度可以达到54.2℃。在4℃、25℃及37℃下用该传感器进行Pb2+的定量检测，检测结果基本相同，表明该传感器可以应用于更宽的温度范围。
　　(2)我们对Cu2+ DNAzyme进行了重构，重构后的结构与之前的DNAzyme结构相似，但是Cu2+的存在却可以显示更高的酶活性。在5μM Cu2+和30μM抗坏血酸的存在下，体系可以获得23倍的荧光信号增长，同时表现出了杰出的灵敏度和选择性，检测限为0.6 nM，线性范围是5-500 nM。Cu2+ DNAzyme传感器中分子内茎-环结构的使用不仅有效地保证了检测体系具有较低的背景荧光，而且茎-环结构的高稳定性(在1.5 M NaCl的存在下解链温度可以达到71℃)还极大地提高了该传感器对温度变化及离子强度变化的耐受能力。我们在4℃、20℃、25℃及37℃下使用该传感器制作了Cu2+检测的标准曲线，发现这四个温度下得到标准曲线几乎完全重合，说明利用该传感器可以在4-37℃的温度范围内给出近乎相同的检测结果。同时我们发现NaCl浓度在0.8-3.0 M时，F/F0基本可以保持不变，也就是说我们设计重构的Cu2+ DNAzyme荧光传感器可以在0.8-3.0M的离子强度范围内进行正常工作。
　　(3)本章基于重构的特异性Cu2+ DNAzyme和G-四链体DNA酶协同作用设计了免标记，价格低廉，操作简单的比色型Cu2+传感器，使用了可形成G-四链体的富G序列及与之互补的部分富C序列，它们分别连接在我们重构的Cu2+ DNAzyme的底物链的5’-端及3’-端，由于重构的Cu2+ DNAzyme会形成分子内茎-环结构，以致富G序列被部分的包埋或部分的形成在该茎-环结构中，当底物链在Cu2+的存在下被切成两段之后，G-四链体结构形成或者被破坏，在氯化血红素(Hemin)的存在下酶活性发生变化，催化H2O2和2，2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)氧化反应能力不同。基于这种原理，设计‘Turn-on’和‘Turn-off’两种比色型Cu2+传感器。对于‘Turn-on’型传感器，由于分子内茎-环结构的形成可以有效的降低其检测背景，而且Cu2+ DNAzyme和G-四链体-Hemin DNA酶的协同放大作用，进一步提高了其检测限，最终其线性范围为8-200 nM，检测限为3.9 nM，同时可以实现裸眼检测。‘Turn-off'模式的原理与‘Turn-on’模式大致相同。虽然‘Turn-off’模式的检测限不如‘Turn-on’模式低，但是同时结合两种模式的比色型Cu2+传感器使用，可以有效的防止假阳性或假阴性结果。同时我们在‘Turn-on’比色型Cu2+传感器的基础上利用Hg2+可以与胸腺嘧啶(T)形成金属碱基对(T-Hg2+-T)的原理来设计新的‘Turn-on’比色型传感器进行检测，检测限达到4.8nM。
　　Ⅱ上转换发光纳米材料在生物检测方面的应用。
　　上转换发光纳米材料是一类吸收低能量光子、发射高能量光子的新型荧光材料，具有化学稳定性好、毒性低、无背景荧光、信噪比高等优点，另外在近红外光激发下具有组织穿透能力深、对生物组织无损伤、近乎零背景荧光干扰、成像灵敏度高等诸多优点，在生物成像和生物分析中有着广泛的应用前景。
　　(4)本章使用水热法一步合成了形貌可控，水溶性好，羧基官能团修饰的NaLuF4∶Yb3+/Er3+纳米材料，在合成中使用小分子二元酸（丙二酸）作为配体，代替了传统方法中使用油酸作为配体，这种合成方法不但解决了上转换纳米材料的水溶性问题，而且合成之后的纳米晶体表面直接修饰有-COOH官能团，可以和多种生物分子偶联，为上转换发光纳米晶体在生物标记应用中灵敏性和特异性的提高提供了前期基础。随后在上转换纳米晶体表面连接单链寡核苷酸DNA分子，利用氧化石墨烯(Graphene Oxide)可以与DNA分子之间形成π-π堆积效应，可完全猝灭上转换荧光的原理，设计了基于单链DNA修饰的上转换纳米晶体与GO之间发生荧光共振能量转移的传感器，进行了核酸外切酶Ⅰ的高灵敏度检测，检测限高达0.02 U·mL-1。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 重金属污染的简介以及我国重金属污染的现状

第二节 脱氧核酶在重金属离子检测中的应用

1．2．1 Pb2+DNAzyme传感器

1．2．2 Cu2+DNAzyme传感器

1．2．3 UO22+DNAzyme传感器

1．2．4 Hg2+DNAzyme传感器

第三节 稀土上转换发光纳米材料

1．3．1 上转换发光机制

1．3．2 上转换纳米材料的表面修饰及功能化

1．3．3 上转换发光纳米材料的主要应用

第四节 选题意义及研究内容

第二章 基于脱氧核酶的Pb2+传感器设计

第一节 实验部分

2．1．1 实验仪器与试剂

2．1．2 Pb2+的荧光检测

2．1．3 Pb2+DNAzyme的熔点(Tm)测定

2．1．4 实际样品中Pb2+回收率的检测

第二节 结果与讨论

2．2．1 Pb2+传感器的设计原理

2．2．2 Pb2+DNAzyme传感器检测条件的优化

2．2．3 Pb2+DNAzyme传感器检测的灵敏度和重现性

2．2．4 Pb2+DNAzyme传感器检测的选择性

2．2．5 Pb2+DNAzyme传感器检测的实际应用

2．2．6 Pb2+DNAzyme传感器在不同温度下的应用

第三节 结论

第三章 Cu2+DNAzyme的重构及相应传感器的设计

第一节 实验部分

3．1．1 实验仪器与试剂

3．1．2 Cu2+的荧光检测

3．1．3 圆二色光谱测定

3．1．4 实际水样中Cu2+回收率的检测

第二节 结果与讨论

3．2．1 Cu2+荧光传感器的设计原理

3．2．2 圆二色光谱检测

3．2．3 抗坏血酸对Cu2+荧光传感器的影响

3．2．4 Cu2+检测的灵敏度和重现性

3．2．5 Cu2+检测的选择性

3．2．6 Cu2+检测的实际应用

3．2．7 温度变化对Cu2+荧光传感器的影响

3．2．7 离子强度变化对Cu2+荧光传感器的影晌

第三节 结论

第四章 利用重构Cu2+DNAzyme与G-四链体DNA酶协同作用进行传感器的设计

第一节 实验部分

4．1．1 实验仪器与试剂

4．1．2 ‘Turn-on’比色型传感器检测Cu2+

4．1．3 ‘Turn-off'比色型传感器检测Cu2+

4．1．4 ‘Turn-on’比色型传感器检测Hg2+

4．1．5 实际水样中Cu2+回收率的检测(应用‘Turn-on’比色型传感器)

4．1．6 实际水样中Cu2+回收率的检测(应用‘Turn-off’比色型传感器)

4．1．7 实际水样中Hg2+回收率的检测

第二节 结果与讨论

4．2．1 ‘Turn-on’比色型传感器检测Cu2+

4．2．2 ‘Turn-off’比色型传感器检测Cu2+

4．2．3 ‘Turn-on’比色型传感器检测Hg2+

第三节 结论

第五章 水溶性NaLuF4：Yb3+／Er3+上转换纳米晶体的制备、表征及其在生物检测方面的应用

第一节 实验部分

5．1．1 实验仪器与试剂

5．1．2 上转换荧光纳米晶体的合成

5．1．3 上转换荧光纳米晶体与单链DNA的偶联

5．1．4 核酸外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)的检测

第二节 结果与讨论

5．1．4 材料合成与表征

5．2．2 荧光光谱及荧光寿命表征

5．2．3 基于上转换荧光共振能量转移检测的原理

5．2．4 氧化石墨烯浓度对上转换纳米晶体荧光猝灭的影晌

5．2．5 核酸外切酶Ⅰ检测的灵敏度及选择性

第三节 结论

参考文献

致谢

个人简历