小鼠胚胎干细胞及人ALT肿瘤细胞中端粒长度的表观遗传调控研究

摘要

小鼠胚胎干细胞是由囊胚内细胞团细胞经体外培养分离而来，其基因表达谱与内细胞团细胞类似，同时也具有无限的自我更新能力及发育上的多能性。小鼠胚胎干细胞自我更新能力及多能性的维持受到体内体外多重因素的复杂调控。小鼠胚胎干细胞中多能性基因并不是均质性表达的，部分基因的表达模式是异质性的，在这些异质性表达的基因中Zscan4是一个表达模式非常特异的基因。Zscan4只在小鼠ES细胞及2细胞胚胎中表达，并且只在3-5％的小鼠ES细胞中表达，表达是时刻发生变化的，Zscan4+及Zscan4-细胞之间可以相互转换。Zscan4在小鼠ES细胞及早期胚胎正常发育中行使着重要的功能，在小鼠ES细胞中Zscan4通过激活端粒末端重组的方式延长端粒并且能够维持小鼠ES细胞基因组的稳定性。在小鼠ES细胞中Zscan4缺失后将导致染色体核型的缺陷，端粒缩短最后细胞不能继续增殖。在早期胚胎发育中缺失Zscan4将导致胚胎发育延迟，囊胚不能有效着床而死亡。Zscan4的独特表达模式表明Zscan4必定受到严格的基因表达调控，但是Zscan4受到怎样的调控目前并不清楚。本论文将探讨Zscan4是如何被控制在3-5％的细胞中表达的，具体的调控机制是如何的，这部分细胞又有着怎样的生物学意义。
　　实验结果表明Zscan4受到Rif1的负调控。Rif1在小鼠ES细胞及睾丸中高表达，在小鼠ES细胞中起着调节ES细胞异质性、维持端粒长度恒定及基因组稳定性的作用。Rif1缺失后通过激活Zscan4的表达从而激活端粒处的染色体重组(T-SCE)以端粒延长替代机制(ALT)来延长端粒，并且端粒融合和丢失加剧。而在Rif1 KD细胞中干扰Zscan4恢复Zscan4的表达后，T-SCE也得到恢复并且异常延长的端粒也得到恢复。高频率的端粒重组将导致端粒缺陷及基因组的不稳定。Rif1缺失导致小鼠ES细胞自我更新能力及多能性显著下降，并且胚胎发育能力也是显著下降的。Rif1缺失引起的缺陷主要由Zscan4高表达介导的异常高的端粒重组引起的，恢复Zscan4的表达后细胞的增殖能力及胚胎发育能力都得到有效恢复。表明Zscan4在小鼠ES细胞中必须维持在恒定的表达水平，表达升高及下降对小鼠ES细胞的自我更新和多能性以及早期胚胎发育都是不利的。有趣的是Zscan4通过自身SCAN结构域激活自身的表达，形成一个正向的回路调控自身的表达。没有Rif1的抑制作用，小鼠ES细胞中将有更多的细胞是Zscan4+阳性的（Rif1缺失后上升到11％左右），从而激活异常高的T-SCE，对小鼠ES细胞是不利的，Rif1在小鼠ES细胞中高表达抑制了这种可能，使Zscan4+维持在3-5％的低水平，维持小鼠ES细胞的正常生物学功能。
　　另外，Rif1是一个转录抑制因子，基因表达谱分析表明Rif1缺失后表达上升的基因数目明显多余下降的基因数目。并且对基因表达谱的详细分析表明部分上升的基因（占上升基因数量的13％）位于亚端粒区域，包括Zscan4、Tcstv1/3等。
　　端粒及亚端粒区域结合着大量的抑制性的表观遗传调控因子，如DNA甲基化修饰、组蛋白甲基化修饰（如H3K9me3及H4K20me3），这些抑制性的表观遗传修饰都是端粒长度的负调节因子。抑制性的表观遗传修饰会有助于形成高度浓缩的异染色质结构，通过端粒位置效应(TPE)抑制临近基因的表达。分子机制上的研究近一步发现Rif1是H3K9甲基化超级复合体中的新成员，特异的与H3K9me3及H3K9me3甲基化超级复合体各成员相互作用，起到稳定H3K9甲基化超级复合体的作用。Rif1的缺失导致介导H3K9甲基化复合体各成分之间相互作用的桥梁不存在了，破坏了H3K9甲基化超级复合体成员之间的相互联系，另外各成员之间的相互作用也减弱了，从而导致不能形成紧密的复合体了。游离的H3K9甲基化超级复合体成员会加速降解，G9a、Setdb1、Kap1、HP1α及Glp蛋白水平都是下降的。H3K9me3甲基转移酶的降解导致H3K9me3甲基化水平的下降以及在Rif1抑制基因启动子处的结合也大为下降，最终解除了Rif1对近着丝粒、端粒及亚端粒区域基因表达的抑制。
　　Zscan4除了受到Rif1的表观遗传调节，我们的结果发现Zscan4也受到Tbx3的表观遗传调节。我们发现Tbx3是一个新的Zscan4+/2C state及端粒长度的调节因子，Tbx3OE降低Dnmt3b的表达及升高Tet2的表达，从而协同地降低小鼠ES细胞中DNA甲基化水平来调节Zscan4的表达及端粒的延长。另外除了受端粒亚端粒处高富集的抑制性的DNA甲基化及组蛋白甲基化表观遗传负调控，Zscan4也受到端粒及亚端粒处少量结合的组蛋白乙酰化的正向调控。我们首次证明组蛋白的乙酰化也同样参与了小鼠ES细胞中端粒长度的调控，并且是通过调节Zscan4等2细胞基因来实现的。
　　端粒酶缺失的晚代小鼠G4 ES细胞虽然增殖能力及多能性较正常的小鼠ES细胞都有所下降，但是仍然能分裂450次之多。维持正常的端粒长度对细胞中正常的生命活动维持有着重要的作用，端粒长度缩短到一定的阈值后将引发细胞的增殖衰老，细胞最终走向死亡。那么在端粒酶缺失的晚代小鼠G4 ES细胞中端粒长度又是怎样变化的呢，通过什么途径来解决端粒末端序列丢失的问题呢？我们结果表明G4 Terc-/-ESC在培养过程中端粒维持在恒定的长度，G4Terc-/-ESC中抑制性的表观遗传修饰DNA甲基化及H3K9me3都是下降的而激活性的AcH3是上升的，从而导致端粒位置效应下降、Zscan4表达上升，补偿因端粒酶缺失而引起的端粒重复序列丢失，进化上完美解决了端粒丢失的问题。另外占人肿瘤10-15％的端粒酶缺失的ALT细胞以ALT机制延长端粒，包括U2OS细胞。在U2OS细胞中H3K9me3是下降的而AcH3是上升的，导致ZSCAN4表达也是显著升高的，同样受到表观遗传的调控。ZSCAN4可能是ALT产生的原因，ZSCAN4的缺失也导致端粒缩短及增殖能力的部分下降，也补偿着ALT细胞端粒长度的丢失，成为肿瘤治疗的有效靶点。端粒酶抑制剂抑制端粒酶阳性肿瘤会使一部分细胞利用ALT机制逃离抑制，限制了其临床应用前景。因此，联合端粒酶抑制剂及ALT抑制剂将可能最终实现治愈肿瘤的目的。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 胚胎干细胞的研究进展

1．1．1 胚胎干细胞的建系与定义

1．1．2 胚胎干细胞的应用前景、遇到的问题及解决办法

1．1．3 胚胎干细胞多能性的维持及分子调控机制

1．1．4 胚胎干细胞的异质性

第二节 端粒

1．2．1 端粒结构与功能

1．2．2 端粒酶

1．2．3 端粒异常与疾病

1．2．4 端粒长度的调控机制

1．2．5 端粒与胚胎干细胞

1．2．6 端粒与肿瘤

第三节 本研究的目的和意义

第二章 Rif1维持胚胎干细胞中端粒长度稳定、多能性和自我更新能力

第一节 导言

第二节 实验材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 载体构建

2．2．3 实验细胞系的建立

2．2．4 短期及长期Rif1干扰细胞的基因表达谱分析

2．2．5 实时定量荧光PCR检测基因表达

2．2．6 Western blot

2．2．7 免疫荧光实验

2．2．8 端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度

2．2．9 定量PCR方法检测不同细胞的端粒长度(T／S ratio)

2．2．10 染色单体定向荧光原位杂交(CO-FISH)

2．2．11 端粒酶活性分析

2．2．12 端粒与损伤基因共定位

2．2．13 细胞周期检测

2．2．14 细胞衰老检测

2．2．15 细胞增殖检测

2．2．16 细胞分化检测细胞的多能性

2．2．17 嵌合体老鼠及胚胎注射实验检测E12．5胚胎的荧光(EGFP)

2．2．18 数据分析

第三节 实验结果

2．3．1 Rif1在ESC及睾丸中高表达

2．3．2 稳定干扰Rif1后影响ES细胞的增殖、分化能力及多能性

2．3．3 Rif1负向调节Zscan4等2细胞基因及Zscan4+细胞比例

2．3．4 稳定干扰Rif1引起端粒长度延长、端粒融合及端粒重组频率升高

2．3．5 稳定干扰Rif1不引起ES细胞中端粒的损伤

2．3．6 在稳定干扰Rif1的细胞中再次干扰Zscan4后能部分恢复细胞增殖能力、异常延长的端粒及高频率的T-SCE

2．3．7 Zscan4 KD能够部分恢复Rif1 KD引起的早期胚胎发育缺陷

第四节 讨论

第三章 Rif1通过维持异染色质沉默来调节Zscan4及端粒长度

第一节 导言

第二节 实验材料及方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 载体构建

3．2．3 启动子活性分析

3．2．4 流式细胞仪检测Zscan4+比例

3．2．5 Western blot

3．2．6 免疫荧光

3．2．7 ChIP-qPCR及数据分析

3．2．8 ChIP-seq及数据分析

3．2．9 免疫共沉淀(Co-IP)

第三节 实验结果

3．3．1 Rif1干扰后激活Zscan4启动子活性及Zscan4通过自身的SCAN结构域激活自身的启动子活性

3．3．2 Rif1结合于端粒亚端粒区域

3．3．3 Rif1干扰后H3K9me3的蛋白水平下降及在Zscan4启动子处结合量下降

3．3．4 Rif1干扰后H3K9me3在基因组水平的结合大大降低

3．3．5 Rif1通过稳定亚端粒异染色质区域H3K9甲基化水平来调控Zscan4的表达及端粒长度

3．3．6 Rif1通过表观遗传调节Zscan4及端粒的模式图

第四节 讨论

第四章 Tbx3通过表观遗传途径调节小鼠胚胎干细胞中的端粒长度

第一节 导言

第二节 实验材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 载体构建

4．2．3 细胞系的构建

4．2．4 实时定量荧光PCR检测基因表达

4．2．5 Western blot

4．2．6 免疫荧光实验

4．2．7 体外三胚层分化实验

4．2．8 流式细胞仪检测Zscan4+的比例

4．2．9 Zscan4启动子活性实验

4．2．10 端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度

4．2．11 定量PCR方法检测不同细胞的端粒长度(T／S ratio)

4．2．12 细胞周期检测

4．2．13 流式细胞仪检测基因组甲基化水平

4．2．14 ChIP-qPCR及数据分析

第三节 实验结果

4．3．1 Tbx3是一个新的ES 2细胞状态调节因子

4．3．2 Tbx3 OE稳定细胞系的构建

4．3．3 Tbx3 OE不影响ES细胞的多能性及体外分化能力

4．3．4 Tbx3 OE延长端粒长度

4．3．5 Tbx3 OE激活Zscan4的表达及启动子活性

4．3．6 Tbx3不直接结合于Zscan4基因的启动子

4．3．7 Tbx3通过调节基因组DNA甲基化水平来调节Zscan4的表达

第四节 讨论

第五章 组蛋白乙酰化水平调节小鼠胚胎干细胞的端粒长度

第一节 导言

第二节 实验材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实时定量荧光PCR检测基因表达

5．2．3 Western blot

5．2．4 流式细胞仪检测Zscan4+的比例

5．2．5 Zscan4启动子活性实验

5．2．6 端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度

第三节 实验结果

5．3．1 组蛋白乙酰化水平调控端粒长度的变化

5．3．2 在Terc-／- G1 ESC中组蛋白乙酰化水平也调控端粒长度的变化

5．3．3 组蛋白乙酰化水平通过调节Zscan4等2细胞基因的表达调节端粒长度

第四节 讨论

第六章 端粒酶缺失的小鼠胚胎干细胞及人肿瘤细胞中维持端粒长度稳定的分子机制

第一节 导言

第二节 实验材料与方法

6．2．1 实验材料

6．2．2 载体构建

6．2．3 实验用细胞系的构建

6．2．4 实时定量荧光PCR检测基因表达

6．2．5 Western blot

6．2．6 免疫荧光实验及数据统计分析

6．2．7 细胞周期检测

6．2．8 细胞增殖能力检测

6．2．9 Zscan4启动子活性实验

6．2．10 端粒定量荧光原位杂交(Q-FISH)检测端粒长度

6．2．11 定量PCR方法检测不同细胞的端粒长度(T／S ratio)

6．2．12 TRF检测端粒长度

6．2．13 流式细胞仪检测基因组甲基化水平

6．2．14 亚硫酸盐测序

第三节 实验结果

6．3．1 G4 Terc-／-ESC中端粒维持稳定的长度而WT ESC中端粒在培养过程中是延长的

6．3．2 端粒大为缩短的G4 Terc-／-ESC中增殖能力下降

6．3．3 Zscan4在G4 Terc-／-ESC中高表达

6．3．4 在G4 Terc-／-ESC中干扰Zscan4后端粒缩短及生长变慢

6．3．5 G4 Terc-／-ESC中亚端粒区域甲基化水平下降

6．3．6 G4 Terc-／-ESC中H3K9me3水平下降、AcH3水平升高

6．3．7 在WT ESC用小分子药物抑制剂介导DNA及H3K9me3的下降能激活Zscan4的表达及延长端粒

6．3．8 人ZSCAN4基因同样能维持端粒酶缺失的人肿瘤细胞的端粒长度

6．3．9 人端粒酶缺失的肿瘤细胞利用与G4 Terc-／-相似的机制来激活ZSCAN4基因的表达

第四节 讨论

第七章 结论与展望

附录

参考文献

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文及研究成果