产α-糖苷酶抑制剂链霉菌株PW609的筛选及活性成分分析

摘要

α-糖苷酶抑制剂可以直接延缓人体肠道中淀粉的消化和吸收，从而降低餐后高血糖，是目前最安全有效的降糖药物之一，研发疗效好、副作用小且作用靶点明确的α-糖苷酶抑制剂类药物一直是口服降糖药物研发的热点。链霉菌是种类和数量庞大的一个微生物类群，具有强大的生物合成能力，一直以来都是人们筛选新型天然化合物的资源宝库。
　　本研究以参与淀粉降解的关键酶——重组人小肠麦芽糖苷酶C端催化亚基(CtMGAM)为靶标蛋白，对71株链霉菌的发酵产物进行筛选。通过测定半抑制浓度IC50的数值，来比较它们对CtMGAM的抑制作用，最终确定了IC50值最小的PW609菌株作为后续研究菌株。
　　根据对菌株PW609进行的形态学特征和生理生化特征实验，以及16S rDNA序列和系统进化分析，它的分类地位被初步鉴定为链霉菌属淀粉酶链霉菌（Streptomyces diastaticus），将其16S rDNA序列提交GenBank，登记号为GQ985448。
　　对PW609菌株进行10-L摇瓶发酵，发酵液通过中空纤维膜超滤、乙醇沉淀、离子交换和大孔吸附树脂以及半制备液相，可以得到α-麦芽糖苷酶抑制剂混合物SE609-Ⅳ。在分离纯化过程中，随着杂质的减少，其对应的半抑制浓度也在减小，达到了分离纯化的目的，最后获得的SE609-Ⅳ回收率0.33％，IC50=0.001823mg/mL。
　　将SE609-Ⅳ与市售的3种α-糖苷酶抑制剂类降糖药物进行对比，发现其抑制作用比阿卡波糖弱5.20倍，但比同样剂量的伏格列波糖和米格列醇的抑制效果分别强2.03倍和27.5倍。说明混合型抑制剂SE609-Ⅳ对CtMGAM具有较高的抑制活性，具有进一步研究的价值。
　　上述实验结果说明，链霉菌PW609的发酵液中可积累一定量的CtMGAM抑制剂，且活性成分的分离纯化方法可行，为进一步得到新的α-糖苷酶抑制剂单体奠定了实验基础，也为寻找新的安全有效的降糖药物提供了新的方法。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 放线菌

1．1．1 放线菌概述

1．1．2 放线菌的分类鉴定

1．1．3 放线菌产生的活性化合物

第二节 糖尿病发病机理

1．2．1 糖尿病概述

1．2．2 碳水化合物消化吸收所需的α-糖苷酶

1．2．3 糖尿病治疗药物概述

第三节 α-糖苷酶抑制剂类降糖药物的研究现状

1．3．1 阿卡波糖

1．3．2 阿卡它定类化合物

1．3．3 伏格列波糖

1．3．4 DNJ

1．3．5 米格列醇

1．3．6 市售常用α-糖苷酶抑制剂类药物

第四节 本文研究的目的和意义

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 主要的实验仪器

2．1．2 实验所用的放线菌和产CtMGAM的酵母菌株

2．1．3 主要培养基的配置

2．1．4 主要的实验试剂及配制方法

第二节 实验方法

2．2．1 CtMGAM抑制剂产生菌株的筛选

2．2．2 α-糖苷酶抑制剂产生菌PW609的菌种鉴定

2．2．3 α-糖苷酶抑制剂产生菌PW609的活性成分提取

第三章 实验结果与分析

第一节 产生α-糖苷酶抑制剂的菌株筛选

3．1．1 以CtMGAM为靶蛋白，在阳性菌株中进行初筛

3．1．2 稳定产生α-麦芽糖苷酶抑制剂菌株的复筛

第二节 菌株PW609的菌种鉴定

3．2．1 形态特征

3．2．2 生理生化特征

3．2．3 16S rDNA序列分析

3．2．4 分类地位的确定

第三节 α-糖苷酶抑制剂产生菌PW609的活性成分提取

3．3．1 链霉菌PW609的发酵

3．3．2 乙醇沉淀

3．3．3 树脂的分离效果

3．3．4 半制备液相色谱的分离效果

3．3．5 α-麦芽糖苷酶抑制剂的纯化结果

3．3．6 a-麦芽糖苷酶抑制剂混合物精制品SE609-Ⅳ的性质

第四章 总结与展望

第一节 总结

4．1．1 α-糖苷酶抑制剂产生菌株的筛选

4．1．2 α-糖苷酶抑制剂产生菌PW609的菌种鉴定

4．1．3 α-糖苷酶抑制剂产生菌PW609的活性成分提取

第二节 展望

参考文献

致谢

个人简历