胞内激活型荧光探针在肿瘤成像中的应用及肿瘤靶向输送基因载体的研究

摘要

第一部分:本实验研究了一种新型的双功能靶向探针(FA-FITC-CathepsinSubstrate-Dabcyl简称FFCD1)用于检测及定位癌症细胞。由于Dabcyl高效的荧光共振能量转移淬灭作用，FFCD1在缓冲液中几乎没有荧光。但是，FFCD1可以在细胞内被激活。对于叶酸受体表达量高的肿瘤细胞，探针FFCD1可以通过叶酸受体介导的内吞途径进入细胞，随后细胞内的Cathepin B将淬灭剂Dabcyl和FITC切开，从而使FITC释放出巨大的荧光。利用流式细胞分析技术及激光共聚焦显微镜，分析和观察不同肿瘤细胞与荧光探针孵育后的结果，我们发现FFCD1对叶酸受体高表达的鼻粘膜上皮细胞(KB细胞)具有高度选择性。同时，KB细胞与不同荧光探针的孵育实验，也进一步验证了叶酸配基与肿瘤细胞表面叶酸受体的高特异性结合能力。FFCD1“自激发”型荧光探针的特殊构造，可以使与其发生特异性结合的肿瘤细胞变得可视化，与“永久开放”型探针相比，可以克服正常组织内非特异性酶的激活、高荧光背景等缺点，提高肿瘤成像对比度和检测灵敏度，使其在临床肿瘤诊断及定位方面具有很大的潜力。
　　第二部分:基于DNA重组技术，我们设计和制备了三种多功能基因重组载体(H5WYG-3H1-NLS-TM, TM-4H1-NLS-GALA, KALA-2H1-NLS-TM)，可以靶向转染特异性癌细胞。这种生物聚合物由四部分组成:(1)具有压缩pDNA能力的、富含精氨酸、组氨酸的重复序列(H)，(2)靶向HER2受体高表达的癌细胞的序列(TM)，(3) pH敏感的溶膜肽，用于破坏溶酶体膜，增强pDNA运输至细胞核的效率(FP)，(4)核定位序列(NLS)。本实验通过对三种载体的制备难度、压缩pDNA能力、靶向性和细胞毒性的比较，得出TM-4H1-NLS-GALA多功能基因重组载体，可以压缩pDNA，避免pDNA被核酸酶降解，靶向HER2受体阳性而非阴性的细胞系，并且能够有效地到靶细胞的细胞核并调节基因的表达。TM-4H1-NLS-GALA多功能基因重组载体对细胞没有明显的毒性，从而提高了生物聚合物的生物适应性。

目录

声明

摘要

第一章 细胞内激活型荧光探针在肿瘤成像中的应用

第一节 前言

1．1．1 癌症

1．1．2 “永久开放”型荧光探针

1．1．3 “自激发”型荧光探针

1．1．4 课题设计思路

第二节 实验材料与方法

1．2．1 材料与仪器

1．2．2 化学实验方法

1．2．3 生物实验方法

第三节 实验结果与讨论

1．3．1 化学合成与表征

1．3．2 HPLC分析荧光探针FFCD1的酶切产物及其在小鼠血清中的稳定性

1．3．3 CathepsinB对荧光探针的激活

1．3．4 生物实验结果与讨论

第四节 实验结论

参考文献

附录

第二章 多功能生物聚合物的癌细胞靶向输送基因载体研究

第一节 前言

2．1．1 基因治疗的研究背景

2．1．2 病毒性基因载体的优缺点

2．1．3 非病毒性基因载体的研究进展

2．1．4 基于重组DNA技术构建生物聚合物的研究进展

2．1．5 课题设计思路

第二节 实验材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

第三节 实验结果

2．3．1 多功能生物聚合物的克隆、表达及表征

2．3．2 生物聚合物对pDNA的压缩及保护能力

2．3．3 不同N：P比对细胞转染效率的影响

2．3．4 生物聚合物靶向模序的功能性检测

2．3．5 细胞毒性实验

第四节 实验讨论

第五节 实验结论

参考文献

致谢

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