产紫杉醇/烷真菌的筛选和聚酮合酶基因的功能性研究

摘要

近些年来，产紫杉醇/烷真菌的筛选不断发展成为是学者们关注的热点，通过微生物发酵法生产紫杉醇的报道也层出不穷。然而，尽管微生物发酵法在一定程度上可以弥补植物提取法生产紫杉醇的某些不足，但筛选高产紫杉醇真菌始终是一个瓶颈，此外真菌生产紫杉醇途径的不稳定性也为紫杉醇的生产提出新的挑战，因此本文目的从两个方面解决真菌发酵的问题，第一，大范围采样筛选紫杉醇高产菌株，认识产紫杉醇真菌的生长环境;第二，研究产紫杉醇真菌的代谢途径，研究控制次级代谢的关键基因，从而为研究紫杉醇生产的稳定性方面打开方向。
　　本文选择富含产紫杉醇真菌最多的植物为材料，从全国多个可能生长产紫杉醇/烷真菌的区域采样，以提高获取此种真菌的概率，另外本文对于采取的样品进行分类处理，按根、茎、叶三部分进行分离纯化，精确定位真菌的生长位置，同时本文研究了高山上生长的植物中产紫杉醇真菌的分布情况，分别在山顶、山腰和山底的植物中进行取样分析，作为以后分离产紫杉醇真菌的借鉴。
　　本实验室广泛研究了产紫杉醇真菌的生存环境，从南京的松树和云南曲靖的红豆杉中分别分离筛选到一株产10-DAB和巴卡亭Ⅲ的腐生真菌NY1b和YN1a，其发酵产物经过HPLC定性定量检测，能够寻找到与10-DAB和巴卡亭Ⅲ标准品保留时间相同的物质且含量较为丰富;以及LC-MS进行精确测定，分别确定该活性物质的分子量，并与标准品进行比对，初步确定该真菌具有生产紫杉醇前体物的功能。
　　聚酮合酶(polyketide synthesis，PKS)是真菌次级代谢过程中聚酮化合物生物合成的关键酶。一些真菌聚酮合酶具有合成药物制剂的功能，而另一些则能够催化合成对人体健康具有巨大伤害的毒素。此外还能合成真菌毒力因子的黑色素。
　　本文通过定向敲除NK101中pks基因，探索所敲除基因在NK101中的作用。本实验研究了5个pks相关基因，通过根癌农杆菌介导的转化办法，分别对5个目的基因进行了定向敲除，敲除后发现pks基因确实有控制色素合成的作用，与野生型相比，敲除菌株的发酵液颜色明显变浅，同时pks基因对菌丝生长和孢子的形成也有一定的影响作用，然而pks基因的敲除对本实验室研究的发酵产物紫杉醇及其类似物的产量影响不大。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 紫杉醇／烷类研究进展

1．1．1 紫杉醇及其衍生物简介

1．1．2 紫杉醇的生产方法研究

1．1．3 微生物发酵法生产紫杉醇的研究

1．1．4 产紫杉醇／烷真菌的介绍

第二节 真菌次级代谢产物

1．2．1 次级代谢与真菌的生长发育

1．2．2 黑色素对真菌孢子形成的影响

1．2．3 真菌次生代谢对信号传导的影响

1．2．4 调控真菌次级代谢物合成的相关基因

1．2．5 真菌次级代谢产物的结构多样化

第三节 真菌聚酮化合物及聚酮合酶的研究进展

1．3．1 真菌聚酮合酶的分类

1．3．2 聚酮合酶的结构和性质

1．3．3 真菌聚酮合酶基因的分析方法

第四节 丝状真菌转化技术的研究进展

1．4．1 农杆菌转化技术(ATMT)简介

1．4．2 农杆菌介导的转化机制概述

1．4．3 农杆菌介导转化的特点研究

1．4．4 影响农杆菌介导转化的因素

1．4．5 农杆菌介导转化方法的应用

第五节 研究目的、意义以及路线

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 研究内容和技术路线

第二章 植物中产紫杉醇／烷真菌的分离、纯化

第一节 实验材料

2．1．1 样品来源

2．1．2 培养基

2．1．3 抗生素与化学试剂

2．1．4 实验仪器和设备

第二节 实验方法

2．2．1 丝状真菌的分离及培养

2．2．2 发酵液中紫杉醇化合物的鉴定

2．2．3 产紫杉醇真菌的表观形态学鉴定

2．2．4 不同区域内植物共生真菌产紫杉醇／烷情况对比

2．2．5 高山区域不同位置植物内生真菌产紫杉醇／烷情况

2．2．6 甘油管保藏真菌菌种

第三节 实验结果

2．3．1 高效液相色谱(HPLC)鉴定发酵产物

2．3．2 液质联用法鉴定发酵产物

2．3．3 国内不同区域产紫杉醇／烷真菌植物的分布

2．3．4 高山不同位置产紫杉醇／烷真菌植物的分布

第四节 讨论

第三章 产紫杉醇／烷真菌NK101聚酮合酶相关基因功能性研究

第一节 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 质粒

3．1．3 培养基

3．1．4 抗生素的配制

3．1．5 实验试剂

3．1．6 引物

3．1．7 实验仪器及设备

3．1．8 计算机软件

第二节 实验方法

3．2．1 PKS相关基因在真菌NK101中的定位

3．2．2 NK-101的培养

3．2．3 利用试剂盒提取质粒

3．2．4 NK-101基因组的提取

3．2．6 OSCAR-pks敲除载体的构建

3．2．7 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备及转化

3．2．8 细菌转化子的筛选和鉴定

3．2．9 细菌甘油管的制备及保藏

3．2．10 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化

3．2．11 NK-101转化子的Southern blot验证

3．2．12 丝状真菌甘油管的制备及保存

3．2．13 NK-101转化子发酵产物的HPLC检测

第三节 实验结果

3．3．1 PKS相关基因在真菌NK101中的初步定位

3．1．2 pks基因定向敲除质粒载体OSCAR-pks的构建

3．1．3 根癌农杆菌LBA4404介导的pks目的基因的定向敲除

3．1．4 pks9基因敲除菌株的Southern blot验证

3．1．5 pks基因定向敲除菌株的菌落形态变化

3．1．6 pks基因缺失对NK-101发酵液颜色产生的影响

3．1．7 pks基因缺失对NK-101次级代谢产生的影响

第四节 讨论

第四章 小结与展望

小结

展望

参考文献

致谢

个人简历