抗EV71病毒中和抗体的筛选及优化研究

摘要

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及EV71病毒，均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和EV71病毒(EV71)最为常见。
　　EV71是隶属于小RNA病毒科肠道病毒属，于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，手足口病EV71病毒可以侵害神经系统，造成一系列的重症表现。出现神经性病毒反应。若患者体质较弱，可能导致呼吸循环系统衰竭。被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”。该病毒已在世界范围内引起十余次手足口病的暴发和流行，且死亡病例处于上升趋势。较为严重的一次是1998年发生在中国台湾暴发的EV71手足口病，共有129000例病例，其中重症病例就多达400个，死亡78例。随后，在中国山东、北京、上海等多个省市有人死亡，2009年115525人感染，353人死亡。EV71引起的手足口病对人类健康、尤其婴儿健康造成巨大威胁，但目前仍无特效抗病毒药物和商品化疫苗问世，因此，研究EV71的感染过程与致病机制并开发抗EV71感染药物显得十分必要和紧急。
　　本实验我们选取从临床死亡病例中分离得到的EV71-HM003207病毒株作为筛选单抗的目标抗原，该病毒株属于C4亚型，它是目前国内EV71感染病例中出现频率最高的病毒亚型，具有一定的代表意义。实验中我们首先利用RD细胞扩增并且纯化了EV71病毒，得到病毒后，免疫BALB/C小鼠，利用杂交瘤技术结合ELISA检测，筛选获得了14株强结合型的单克隆抗体;体外的中和保护实验证实:12B6、2B6、1G6、2G12、6G5分泌的抗体能够有效保护RD细胞不受EV71病毒侵染，12B6、6G5、2B6、2G12、7G6、7E6分泌的抗体能够有效保护SK-N-SH细胞不受EV71病毒侵染，具有中和保护作用，2G12、3G12、12H3、7G6、13A12分泌的抗体有很强的结合能力。由于12B6和2B6均能有效保护RD和SK-N-SH细胞不受EV71病毒侵染，我们选取这两株单克隆抗体，将它们的可变区与人抗体的恒定区连接，组成了人源化的嵌合抗体。本研究为今后EV71感染的诊断、治疗以及抗体分析等方面奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 手足口病和EV71病毒概述

1．1．1 EV71病毒的发现

1．1．2 EV71病毒的病毒学概述

1．1．3 EV71的分子流行病学概述

1．1．4 EV71病毒的传染方式和发病机理

第二节 研究目的和意义

第二章 抗EV71病毒单克隆抗体的筛选

第一节 实验材料

2．1．1 细胞株、实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 常用培养基和缓冲液的配制

第二节 实验方法

2．2．1 EV71病毒培养、纯化

2．2．2 抗EV71病毒单克隆抗体的筛选

2．2．3 腹腔注射杂交瘤获取单克隆抗体实验

2．2．4 纯化腹水抗体

2．2．5 单克隆抗体的鉴定实验

第三节 实验结果与分析

2．3．1 EV71病毒单克隆抗体的筛选

2．3．2 腹水制备单克隆抗体

2．3．3 单克隆抗体的纯化

2．3．4 单克隆抗体结合表位的初筛

2．3．5 结合型单克隆抗体的筛选

2．3．6 单克隆抗体的中和性能鉴定

2．3．7 单克隆抗体亚型的测定

第三章 制备和鉴定抗EV71病毒嵌合抗体

第一节 实验材料

3．1．1 菌株和细胞株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 实验仪器

3．1．4 常用培养基及缓冲液的配制

第二节 实验方法

3．2．1 克隆抗EV71病毒单克隆抗体可变区基因

3．2．2 PCR扩增得到基因VH和VL+CL并将其转入真核表达载体

3．2．3 嵌合抗体12B6和2B6的表达

第三节 实验结果与分析

3．3．1 抗EV71病毒单克隆抗体可变区基因的克隆

3．3．2 PCR获得VH和VL+CL基因并转入真核表达载体

3．3．3 嵌合抗体2B6和12B6的表达结果

第四章 全文总结与讨论

参考文献

致谢

个人简历