神经降压素受体蛋白在昆虫细胞中的高效表达和稳定突变体的研究

摘要

G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors，GPCRs）是一类具有七次跨膜α螺旋的蛋白超家族，下游信号分子是异源三聚体的 G蛋白，也是最大的蛋白受体超家族之一。GPCRs是一类非常重要的信号分子受体，在信号转导中起着至关重要作用，参与了发育、神经、生殖、生长以及感知等多种生命活动及代谢和内分泌等多种生理生化反应；同时，GPCRs基因的突变及多态性还与肿瘤、糖尿病、心脏病、免疫以及感染性疾病等重要疾病的发生、发展及临床治疗密切相关。目前，GPCRs在制药领域中占有极其重要的地位，大量的药物可以作为配体靶向作用于GPCRs而起到治愈疾病的目的。因而，G蛋白偶联受体高分辨率的晶体结构的解析及深入的功能研究成为了新型药物设计研发的迫切需求。
　　NTS（Neurotensin,神经降压素）是由13个氨基酸组成的神经性短肽。NTS具有十分广泛的生物学活性，并且在帕金森综合征精神分裂症多巴胺神经传导的调控以及镇痛和低体温证上扮演了极为重要的作用，甚至对癌细胞的生成过程也具有极大的推动作用。目前已经发现的NTS受体（NTSR）有三种亚型中， NTSR1和NTSR2是具有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体的A家族的成员，介导NTS信号的传递。而NTSR3只具有单次跨膜的的分选蛋白。现研究较多的是NTS作用于NTSR1介导的Gq蛋白的信号传导作用。
　　GPCRs的蛋白结构对其后期的各功能研究及相关药物的研发有着至关重要的作用，然而野生型的GPCR蛋白通常存在表达量低，高聚严重，均一性和热稳定性差等不利于后期的结晶的问题。研究中我们针对人源和小鼠NTSR1受体蛋白，借鉴解得结构的rat NTSR1的纯化结晶等过程，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，在sf9昆虫细胞中筛选高表达的NTS受体蛋白，并通过对蛋白的结构进行一系列的改造以及纯化条件的优化等方法改善蛋白性质及其在溶液中的分散状态，提高蛋白的热稳定性，力图获得稳定突变的NTSR1构造，为其结构解析及相关药物设计研究奠定基础。

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第一章 前言

第一节GPCR相关介绍

1.1.1 G蛋白偶联受体的概述

1.1.2 G蛋白偶联受体的分类

1.1.3 GPCRs蛋白结构，生理功能及信号传导途径

1.1.5 GPCR研究方法、目的和研究意义

第二节 NTS 及其受体的研究背景

1.2.1 NTS概述：

1.2.2 NTSR1结构概述

1.2.3 NTSR1生理功能

1.2.3 NTSR1研究意义

1.2.4 NTSR1配体信息

第三节 GPCR蛋白的稳定性

1.3.1 GPCR蛋白稳定性的概述

1.3.2 GPCR结构的保守性

1.3.3 突变GPCR结晶的方法

第四节 实验原理和技术

1.4.1 Overlap PCR进行分子克隆

1.4.2 昆虫表达体系及目的基因在昆虫表达体系中的表达

1.4.3 实验技术

第二章 材料与方法

第一节 实验试剂

第二节 实验方法

2.2.1获得目的基因

2.2.2 pFastBac1重组质粒的构建

2.2.3 阳性重组Bacmaid的获得

2.2.4 重组蛋白的表达

2.2.5 重组目的蛋白的表达

2.2.6 重组目的蛋白的小量纯化

2.2.7 目的蛋白的大量纯化

2.2.8 目的蛋白性质分析方法

第三章 NTSR1 在昆虫细胞中表达和优化

第一节 NTSR1 生化性质的分析

3.1.1 NTSR1氨基酸序列

3.1.2 NTSR1理化性质分析

3.1.3 NTSR1二级结构预测

第二节 hNTSR1，mNTSR1蛋白优化

3.2.1 细胞色素B562RIL和T4L（T4溶菌酶C端序列）基因序列

3.2.2 细胞水平的GFP融合蛋白的荧光筛选

3.2.3 NTSR1的截短优化

3.2.4 NTSR1的插入优化

3.2.5 NTSR1的位点突变

3.2.6 NTSR1的拮抗剂配体的筛选：

第三节 实验结果的讨论

第四章 展望

参考文献

致谢

附录

1.1. 实验仪器

1.2. 实验试剂

个人简历