叶酰聚谷氨酸合成酶功能冗余的分析及GDCT干扰载体的构建

摘要

叶酸作为一碳单位转移的重要辅助因子，对植物的生长非常重要。当叶酸合成受到阻碍时可以导致严重的发育异常，包括胚胎死亡、幼苗死亡、晚花和植株败育等各种现象。拟南芥叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)催化叶酸合成的最后一步，存在3个定位不同细胞区域的同源序列——定位于质体的DFB、定位于线粒体的DFC和定位于胞质的DFD。任何一种FPGS的单突变体在正常土壤环境中生长时没有明显表型，但双突变体则呈现植物矮化或败育等现象，说明叶酰聚谷氨酸合成酶的功能存在冗余。在低氮条件下dfc突变体与野生型植株相比其主根明显变短且叶酸含量降低，并且两天时在dfc突变体中检测到DFB基因的表达量明显升高，故推测低氮胁迫下DFB基因可能对dfc突变体中DFC基因的缺失具有补偿作用。因此本论文通过在dfc突变体中过表达DFB，观察低氮条件时dfc背景下DFB过表达植株的根长表型、植物体内叶酸和氮代谢在转录水平上的扰动和叶酸含量的变化，来探讨FPGS同工酶的功能冗余对植物低氮胁迫反应的影响。
　　此外，叶酸是光呼吸过程中甘氨酸脱羧酶GDCT的重要辅酶因子，对低氮条件下生长的dfc突变体进行高浓度二氧化碳处理（即非光呼吸条件）时，其主根长度和叶酸的含量也得到恢复，说明叶酸可能通过影响光呼吸而参与拟南芥的低氮胁迫反应。因此本论文还试图通过采用构建GDCT的RNAi载体、转化拟南芥的方法，尝试在植物体内使GDCT的表达水平降低，以探讨由于叶酸与GDCT蛋白相互作用的变化导致了dfc突变体不能适应低氮胁迫的可能性。
　　目前本论文取得的主要成果如下:
　　1、Gateway过表达系统构建PH2GW7-DFB过表达载体，通过农杆菌侵染dfc突变体的拟南芥花朵，所得到的种子在含有潮霉素抗性的1/2MS平板上进行抗性筛选和基因鉴定，得到30株过表达植株;
　　2、将获得的过表达株系进行反转录RT-PCR分析，结果显示过表达株系体内的DFB表达量与dfc和野生型相比确实升高;
　　3、在9.4N培养基上生长3天时，过表达株系的主根长度达到WT根长的110％～160％，与dfc根长差异显著;在0.3N培养基上生长3天，DFB过表达株系的主根更接近WT的主根长度，均比dfc主根长，且与dfc长度差异极显著。由此可得知，无论在9.4N或是0.3N条件下，过表达株系的根长均得到不同程度的恢复，低氮条件下过表达DFB可以促进dfc主根伸长，弥补DFC缺失造成的根长变短。
　　4、在低氮条件下，dfc突变体中与叶酸代谢和氮代谢相关基因如10-甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、谷氨酰氨合成酶1.1和硝酸根转运蛋白2.1的转录水平在适应低氮胁迫中变化的模式与WT不同，而在dfc中过表达DFB基因后植物在适应低氮时的这些基因的相关扰动都恢复至更接近WT，说明DFB基因能一定程度上弥补DFC功能缺失对叶酸与氮代谢造成的扰动。
　　5、采用HPLC/MS/MS测定生长3天的过表达株系体内叶酸含量变化。在9.4N条件下，过表达株系的5-F-THF的含量达到WT的110％左右，与dfc相比其含量显著增加。而在0.3N条件下，过表达株系中5-F-THF的含量与WT相似，比dfc明显增加，其差异极显著。这说明在dfc中过表达DFB在一定程度上可以弥补DFC基因缺失造成的叶酸含量降低。
　　6、设计GDCT基因序列的同源序列，通过Gateway将同源序列分别正向和反向插入PK7WIWG2的两个不同位置，经过基因鉴定、酶切鉴定及测序等方法进行鉴定，最后成功构建GDCT的RNAi载体。
　　总体来说，本论文初步探讨了叶酰聚谷氨酸合成酶FPGS在适应低氮胁迫过程中的功能冗余，同时通过Gateway成功构建RNAi-GDCT载体，为能进一步探讨叶酸如何参与光呼吸打下基础。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 叶酸

1．1．1 叶酸简介

1．1．2 叶酸合成

1．1．3 叶酰聚谷氨酸合成酶研究概况

1．2 叶酸与光呼吸

1．2．1 光呼吸简介

1．2．2 叶酸参与光呼吸途径

1．3 叶酸与氮代谢

1．3．1 氮代谢概况

1．3．2 GS-GOGAT循环途径

1．3．3 叶酸对氮利用的影响

1．4 RNAi技术

1．4．1 RNAi的发现

1．4．2 RNAi发挥作用的过程

1．4．3 RNAi技术的重要意义

1．5 本论文目的及意义

2 在DFC缺失的突变体中过表达DFB

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体

2．1．3 菌种

2．1．4 工具酶

2．1．5 试剂盒

2．1．6 分子量标准

2．1．7 化学试剂

2．1．8 引物合成及测序

2．1．9 叶酸测定

2．2 实验方法

2．2．1 扩增目的片段

2．2．2 转化感受态大肠杆菌

2．2．3 酶切体系

2．2．4 农杆菌转化

2．2．5 DFB过表达载体利用花蘸法转化野生型拟南芥

2．2．6 1／2 MS固体培养基的配置

2．2．7 过表达植株的抗性筛选

2．2．8 植物DNA快速提取

2．2．9 过表达植株的PCR鉴定

2．2．10 过表达植株RNA提取

2．2．11 RT-PCR鉴定

2．2．12 过表达植株叶酸含量测定

2．2．13 不同氮源培养基的配置

2．2．14 平板上培养拟南芥幼苗

2．3 结果

2．3．1 PH2GW7-DFB载体构建

2．3．2 过表达株系的鉴定

2．3．3 PH2GW7-DFB过表达植株的低氮胁迫反应

2．3．4 叶酸和氮代谢相关基因转录水平分析

2．3．5 叶酸含量分析

3 构建GDOT的RNAi载体

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 载体

3．1．3 菌种

3．1．4 工具酶

3．1．5 试剂盒

3．1．6 分子量标准

3．1．7 化学试剂

3．1．8 引物合成及测序

3．2 实验方法

3．2．1 扩增目的片段

3．2．2 转化感受态大肠杆菌

3．2．3 酶切体系

3．2．4 农杆菌转化

3．3 实验结果

3．3．1 设计序列

3．3．2 G1与pEASY-Blunt连接

3．3．3 G1与pENTR3C载体连接

3．3．4 G1与目的载体PK7WIWG2连接

3．3．5 农杆菌转化

4 结论与讨论

4．1 在DFC缺失的突变体中过表达DFB

4．2 RNAi载体构建

致谢

参考文献