甜高粱SSADH基因克隆鉴定及耐盐高粱品种的筛选

摘要

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）代谢途径是TCA循环的一个代谢旁路途径，在动物中枢神经系统中发挥重要作用；而植物中，与植物响应各种生物胁迫和非生物胁迫密切相关。琥珀酸半醛脱氢酶 SSADH是 GABA途径的一个关键酶，不可逆性地催化琥珀酸半醛形成琥珀酸，后者进入三羧酸循环。已有的研究表明该基因与植物的生长发育、逆境胁迫应答密切相关。甜高粱是一种重要的生物能源作物，具有多种抗逆特性，因此克隆并鉴定这些优良的抗逆基因对于作物的遗传育种改良具有重要意义。但是SSADH在甜高粱抗逆性中所起的作用，目前尚不清楚。本研究首次从甜高粱中克隆获得了SSADH基因的编码区序列；并对其进行了原核表达和酶活测定、亚细胞定位分析，同时利用农杆菌介导法进行高粱幼胚遗传转化，创建基因过表达株系等方面进行了研究。为今后深入研究SSADH基因与甜高粱抗性的关系提供重要依据。主要结果如下：
　　1、利用RT-PCR技术首次从甜高粱Keller中克隆到了SSADH基因编码区序列。该序列全长1584bp，编码527个氨基酸，分子量大约是52.45KD；基因结构与功能在线分析显示基因具有琥珀酸半醛脱氢酶活性结构域，和一个24个氨基酸的信号肽；与已知物种的SSADH基因编码区序列比对发现，序列相似度较高，仅信号肽部分差异较大。
　　2、构建两个原核表达载体：一个全长的表达载体pET-28a-SSADH（1584）和截掉信号肽的原核表达载体pET-28a-SSADH（1386），仅pET-28a-SSADH(1386)表达出了SSADH蛋白；通过Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化出目的蛋白；并测出了蛋白的酶活，结果表明蛋白具有琥珀酸半醛脱氢酶的酶活，测得酶活为0.042 units/mg蛋白；同时研究发现加入SSADH酶的抑制剂AMP和ATP后，酶活被抑制。
　　3、构建SSADH基因序列与GFP报告基因的融合表达载体，利用烟草叶片瞬时表达系统进行亚细胞定位分析，激光共聚焦显微镜（CLSM）分析结果表明，SSADH定位于线粒体中，与SSADH基因的功能预测相吻合。qRT-PCR分析了6个品种甜高粱的幼叶SSADH基因的表达情况，发现基因的表达差异不大。
　　4、本实验通过构建甜高粱SSADH基因的过表达载体pH7WG2D-SSADH，并以农杆菌侵染法，转化高粱BTX-SKU的愈伤组织，以潮霉素作为筛选剂，潮霉素筛选压50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml依次增加，经过三轮筛选，获得SSADH基因的抗性愈伤；抗性愈伤已经进入再生培养和生根培养。
　　5、实验通过0mM、100mM、200mM三个浓度梯度的NaCl处理11个不同的高粱种子；统计10天的发芽情况，并10天后收获幼苗、测量幼苗根重、根长、苗重和苗长分析高粱的耐盐性。筛选得到一个相对耐盐品种泰斯和一个盐敏感的品种10-80。
　　以上研究结果为更进一步的研究甜高粱 SSADH基因在甜高粱抗性特性中的具体功能和甜高粱育种奠定了一定的基础。

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第一章 绪论

1.1背景介绍

1.2甜高粱的基本介绍

1.3 甜高粱研究与利用

1.4 GABA途径的研究

1.5 GABA代谢途径的生物学功能

1.6 SSADH的研究进展

1.7 本研究的目的及意义

1.8 技术路线

第二章 甜高粱SSADH基因克隆及生物信息学分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果分析

2.4 讨论与分析

第三章 甜高粱SSADH蛋白原核表达及酶活测定

3.1 材料试剂

3.2 试验方法

3.3 结果分析

3.4 讨论与分析

第四章 甜高粱SSADH基因的亚细胞定位及表达分析

4.1 材料与试剂

4.2 试验方法

4.3 结果分析

4.4 讨论与分析

第五章 甜高粱SSADH基因过表达植株的获得

5.1 材料试剂

5.2 实验方法

5.3 结果分析

5.4 讨论与分析

第六章 耐盐性高粱品种的筛选

6.1 材料与方法

6.2 实验方法

6.3 实验结果

6.4 讨论与分析

第七章 总结

7.1 甜高粱SSADH基因的克隆

7.2 甜高粱SSADH基因原核表达及酶活测定

7.3 甜高粱SSADH亚细胞定位及表达分析

7.4 甜高粱SSADH基因过表达植株的获得

7.5 耐盐性高粱品种的筛选

致谢

参考文献

附图一

附录二

附录三

攻读硕士学位期间发表的论文及研究成果