不同启动子驱动DR1172转基因甘蓝型油菜的抗旱性研究

摘要

干旱是植物生长发育过程中影响最大的非生物胁迫因素之一，它严重制约了全球农业的发展。目前，对植物的抗旱机理，以及培育具有抗旱的转基因新品种成为研究的热点。甘蓝型油菜，属于十字花科芸薹属，是植物蛋白和植物油主要来源之一。在我国，因干旱导致油菜年产量损失达20％以上。近来，利用基因工程技术，通过转入外源过表达基因来提高油菜的抗逆能力已经取得一定的成效，而增加的油菜抗逆功能的同时，又不影响油菜的品质和产量也受到了更多的关注。
　　本实验，分别构建CaMV35S和AtPUB19启动子驱动的DR1172基因的植物表达载体，利用农杆菌介导法转入甘蓝型油菜中，从而研究不同启动子对转DR1172基因甘蓝型油菜的抗旱性能力的影响，以及对转基因油菜生理生化造成的差异，最终筛选出综合性状良好的油菜新品种。
　　目前，取得的成果如下：
　　（1）分别构建了植物表达载体pCambia-AtPUB19::DR1172和PBI121-CaMV35S::DR1172，并成功转化EHA105感受态细胞。
　　（2）通过使用分析软件，发现AtPUB19启动子顺式作用元件上含有与干旱、脱水相关应答的元件、启动子和增强子的保守元件、启动子的核心保守序列，以及预测的两个转录起始点。
　　（3）利用农杆菌介导法分别将EHA105中的植物表达载体转入甘蓝型油菜中，通过PCR检测，发现含有pCambia-AtPUB19::DR1172的转基因植物78株和含有PBI121-CaMV35S::DR1172的转基因植物46株。
　　（4）采用PEG6000模拟干旱实验处理的方法，分别对T1代种子（非转基、转AtPUB19::DR1172、转CaMV35S::DR1172）进行不同PEG浓度的胁迫处理实验，以及20%PEG浓度下不同时间的胁迫处理实验。结果显示，在不同干旱情况下，CaMV35S和AtPUB19启动子都可有效的驱动DR1172基因的表达，但高度干旱胁迫时，与CaMV35S启动子相比较，AtPUB19启动子可更高效的驱动DR1172基因的表达，且显著提高油菜叶片的抗氧化酶活性。在不同时间的干旱胁迫后，转CaMV35S::DR1172基因组和转AtPUB19::DR1172基因组油菜叶片的抗氧化酶活性呈现上升趋势，而非转基因组呈先上升再下降的趋势。同时，CaMV35S启动子和AtPUB19启动子可驱动DR1172基因可缓解MDA对植物组织造成的伤害。AtPUB19启动子驱动的DR1172基因也减缓了叶绿素含量、相对含水量的降低速率，相对电导率的增加速率，以及提高了脯氨酸含量和可溶性糖含量，降低了干旱对植物造成的损失程度。
　　（5）实时荧光定量PCR结果表明，随着干旱胁迫时间的持续性增加，CaMV35S启动子驱动DR1172基因在油菜叶片中的相对表达量维持在一个较低的水平，而AtPUB19启动子驱动的DR1172基因组在油菜叶片中的相对表达量随着干旱时间的增加而呈现较高的水平。
　　（6）根据20%PEG处理不同时期的油菜叶片，其形态特征变化显示，高度干旱胁迫可提高AtPUB19启动子驱动DR1172基因的抗旱水平，且高于CaMV35S启动能力。说明了CaMV35S驱动的基因在油菜表达中不具有时间特异性和组织特异性，而AtPUB19可根据植物不同的发育阶段和生长环境，对外源基因的表达进行定时、定点、定量的诱导表达，从而缓解干旱对其形状和品质的不良影响。