肝素化聚乳酸电纺纤维控释碱性成纤维细胞生长因子的研究

摘要

静电纺丝技术制备的纤维膜由于具有高比表面积和类似于天然细胞外基质的纳米尺度结构，在药物释放载体及组织工支架方面显示出很大的应用潜力。将携载生物活性大分子电纺纤维作为组织工程支架，在为细胞增殖和迁移提供支撑的同时，可通过释放生物活性物质以调控细胞功能、促进细胞外基质分泌以及加快组织再生。聚乳酸的生物降解率较高且其降解产物无毒，已被广泛用作医用缝线、组织工程支架和药物控释载体。但是采用静电纺聚乳酸纤维膜由于其表面疏水，导致纯聚乳酸纤维支架细胞亲和性差，限制其在组织工程领域的应用。本文旨在通过开环共聚的方式制备主链上含有活性功能基团的功能化聚乳酸，并制备成电纺纤维，随后通过活性官能团在纤维表面接枝肝素，进而利用肝素对细胞生长因子的亲和作用在纤维上载入生长因子，达到保护其生物活性、控制其持续释放的目的。
　　 本研究是通过Baeyer-Villiger氧化反应制备功能单体5-乙二醇缩酮-ε-己内酯(TOSUO)，以辛酸亚锡为催化剂让其与丙交酯、ε-己内酯开环共聚得到聚合物PCTA，进而用三苯基四氟硼酸碳使该聚合物主链上的缩酮基脱保护，制备主链上具有羰基功能基团的聚乳酸共聚物PCOA。继而通过该功能基团在聚合主链上引入“手臂分子”对氨基苯乙醇，得到主链上含有突出羟基的聚合物PCAAP。红外光谱、核磁共振谱验证了聚合物的结构，凝胶渗透色谱表证了聚合物的分子量在5万左右。参照ISO10993-5标准方法评价聚合物PCAPP的材料毒性，结果表明制备的聚合物基本没有细胞毒性。
　　 采用静电纺丝技术成功地制备了PCAAP纤维，纤维粗细均匀，纤维膜是多孔结构。通过化学接枝的方法，在PCAAP纤维膜上接枝了不同分子量的肝素，通过调节肝素的浓度可以调控纤维上接枝肝素的总量。用甲苯胺蓝法对纤维上接枝的肝素进行定量表征，结果表明当接枝肝素浓度低于4％时，肝素接枝量随着浓度增加而增加，当肝素浓度为4％时纤维表面肝素接枝量最大，为112.4±3.2 ng/cm2。肝素化PCAAP纤维的力学性能和表面润湿性结果表明，制备的纤维膜力学强度满足皮肤支架的要求。通过降解聚合物的结构分析，结合纤维降解前后分子量变化、重量变化，研究PCAAP纤维的降解行为，结果表明PCAAP纤维的降解首先发生在聚乳酸链段上，属于本体降解，随着降解时间的增长，聚合物中聚己内酯链段比例增加。
　　 利用肝素与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)之间的亲合作用，在肝素化纤维支架上成功地载入bFGF，bFGF的载入量于纤维上肝素的接枝量成正比，可以通过控制不同分子量肝素浓度来控制肝素的接枝总量，来达到控制纤维上bFGF载入量相同的目的。体外释放结果表明，电纺纤维上肝素接枝量、接枝肝素的分子量、释放介质等影响bFGF的释放行为，能使bFGF持续释放3周。纤维上接枝肝素的量越多、接枝肝素分子量越低，bFGF的释放速度越慢；而以细胞培养液为释放介质由于其中存在的蛋白等导致bFGF的释放稍快。通过体外细胞试验，自由的bFGF只能在短期内促进细胞的粘附、增殖和胶原的分泌，而肝素化纤维上载入bFGF的活性保持较好，释放后能有效地促进细胞的粘附、增殖和胶原的分泌。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 绪论

1.1组织工程支架

1.1.1组织工程支架的特点

1.1.2细胞生长因子及其作用

1.1.3组织工程支架中构建细胞因子控释体系

1.2静电纺聚合物纤维

1.2.1电纺纤维的特点

1.2.2电纺纤维用作药物控释载体

1.2.3电纺纤维用作组织工程支架

1.2.4电纺纤维携载细胞因子作为组织工程支架

1.3肝素与细胞生长因子

1.3.1肝素的特点

1.3.2肝素对细胞因子的保护作用

1.3.3利用肝素的亲和性来控释生长因子

1.4改性聚乳酸电纺纤维

1.4.1聚乳酸的改性

1.4.2聚乳酸电纺纤维的改性

1.5课题的立题意义和研究内容

1.5.1研究目的和意义

1.5.2研究内容和方法

1.5.3论文的创新点

第2章 功能化聚乳酸的合成与表征

2.1实验部分

2.2.1实验材料

2.1.2 5-乙二醇缩酮-ε-己内酯(TOSUO)的合成

2.1.3聚合物poly[(ε-CL)-co-TOSUO-co-(DL-LA)](PCTA)的合成

2.1.4聚合物poly[(ε-CL)-co-OPD-co-(DL-LA)](PCOA)的制备

2.1.5聚合物poly[(ε-CL)-co-OPD-co-(DL-LA)]AP(PCAAP)的制备

2.1.6聚合物结构的表征

2.1.7聚合物的毒性检测

2.2结果及分析

2.2.1功能单体TOSUO的表征

2.2.2聚合物PCTA的表征

2.2.3聚合物PCOA的表征

2.2.4聚合物PCAAP的表征

2.2.5聚合物的分子量检测

2.2.6材料毒性分析

2.3 小 结

第3章 肝素化聚乳酸电纺纤维的研究

3.1 实验部分

3.1.1实验材料

3.1.2功能化聚乳酸电纺纤维的制备

3.1.3电纺纤维上肝素的接枝

3.1.4电纺纤维膜的表征

3.1.5电纺纤维上肝素接枝量的测定

3.1.6电纺纤维的体外降解实验

3.2结果及分析

3.2.1电纺纤维膜的表观形貌

3.2.2电纺纤维膜的表面润湿性

3.2.3电纺纤维膜的力学性能

3.2.4电纺纤维的表面元素分析

3.2.5肝素化纤维的定性检测

3.2.6电纺纤维上肝素的接枝量

3.2.7电纺纤维的体外降解行为

3.3小结

第4章 载生长因子聚乳酸电纺纤维膜的研究

4.1实验部分

4.1.1实验材料

4.1.2电纺纤维上bFGF的携载

4.1.3电纺纤维携载bFGF量的测定

4.1.4电纺纤维携载bFGF的释放

4.1.5细胞和纤维的准备

4.1.6细胞在纤维上的种入

4.1.7细胞在纤维上行为的表征

4.1.7细胞分泌细胞外基质的表征

4.1.8统计学分析

4.2结果及分析

4.2.1电纺纤维上bFGF的载入量

4.2.2 电纺纤维上bFGF的体外释放行为

4.2.3细胞在不同肝素接技量纤维膜上的生长行为

4.2.4细胞在接技不同分子量肝素纤维膜上的生长行为

4.2.5纤维上细胞的组织分析

4.3 小 结

全文结论

参考文献

附录

致 谢

攻读硕士期间发表及待发的论文