猪链球菌金属依赖转录调节基因mtsR研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)为革兰阳性溶血性兼性厌氧球菌，根据其荚膜多糖抗原性的差异，分为35个血清型，其中以猪链球菌2型(SS2)中国分离株毒力最强、危害最严重、流行最广，是一种重要的人兽共患病病原体。我国江苏和四川部分地区曾经在1998年和2005年暴发SS2感染的大面积流行，导致上万头生猪死亡上百人感染发病，几十人死亡，受到全球关注，猪链球菌2型感染已成为成为了公共卫生防疫的重点。
　　虽然近年来我国对猪链球菌2型的毒力因子及其有关发病机制的研究取得了进展，但该菌生理生化、遗传特性、毒力和致病机理方面还有很多未解之谜，猪链球菌2型中国分离菌株如何获得必需的金属元素铁及其调控机理就是其中之一。
　　为此，本研究通过细菌形态学观察、革兰氏染色镜检和16SrDNA序列同源性分析等方法与技术，从四川成都附近某养猪场分离获得一株与NCBI数据库中05ZYH33(猪链球菌2型中国分离毒株)同源性达到99％的猪链球菌菌株SS86；对该分离菌株的七个主要毒力因子CPS，MRP，EF，Sly，GDH，FBPS和ORF2的基因PCR检测结果表明，本实验分离菌株与目前报道的2型猪链球菌的多数致病株毒力因子分布情况一致；将分离菌株培养在添加浓度为250μM的铁专一螯合剂4，4’-联吡啶(Dipyridyl，DPD)的链球菌THYB培养基中，分离菌株SS86几乎不能生长，在含DPD螯合剂的THYB培养基中，分别添加1.5μM浓度的Fe2+，1.0μM浓度的Fe3+和30μM浓度的血红蛋白时，菌株SS86可恢复到正常生长水平，表明铁元素为猪链球菌SS86生长繁殖所必需；为了今后进一步弄清猪链球菌2型中国分离株铁元素吸收和调节机理，本实验以分离株SS86为出发菌株，采用基因敲除缺失突变/温度敏感自杀性质粒/电转化方法，构建了金属依赖转录调节基因mtsR缺失突变株。用RT-PCR检测mtsR基因缺失对猪链球菌金属离子吸收系统Fhu、Feo、Mut和Mts操纵子的金属离子绑定相关基因fhuA、feoA，mutA和mtsA以及铁吸收调节基因fur的表达影响，研究结果显示，野生菌株和mtsR基因缺失突变株的铁吸收操纵子金属元素绑定基因及调节基因fur表达存在差异，研究结果确认了猪链球菌SS86菌株MtsR影响猪链球菌铁吸收转运相关基因表达。
　　本研究结果不仅让我们对猪链球菌中国分离株的毒力基因分布、铁元素对菌株生长繁殖影响以及金属依赖转录调节基因mtsR对金属元素吸收操纵子金属元素绑定基因及调节基因fur表达的调节有了较为系统的了解，同时也为我们今后进一步深入研究猪链球菌2型菌株金属离子吸收调控机理以及揭示猪链球菌致病机理奠定了基础。