钛表面透明质酸微图形调控血管内膜形成的研究

摘要

心血管植入材料表面内皮化被认为是防止植入后血栓和内膜增生的主要途径，因此提高这类生物材料的表面内皮化质量是非常重要和有意义的。目前，体外研究证明在生物材料表面覆盖完整的内皮层具有一定的抑制血栓形成和平滑肌细胞增生的作用。但是，这种材料表面单一细胞形成的内膜植入体内后，存在抗凝血功能不足和容易大面积脱落等问题。为了解决这一问题，更多的研究转向如何实现体内内皮化，但对材料表面内皮细胞周细胞环境和仿流体剪切力环境的构建与改善的研究也不可缺少。基于此，本文在构建与改善材料表面内皮细胞周细胞环境和仿流体剪切力环境的基础上，进行了材料表面仿生内膜构建的相关研究。
　　本文采用具有较好生物相容性的钛(Ti)作为基底材料，利用Ti表面透明质酸(HA)条带微图形模拟体内流体剪切力对内皮细胞(ECs)的拉伸力学作用;利用微图形对平滑肌细胞(SMCs)的限制作用为内皮细胞提供仿生的平滑肌周细胞环境;同时构建了利用透明质酸酶(HAa)水解HA以实现ECs和SMCs的有序共培养(SMCs-HAa-ECs)和利用四型胶原(ColⅣ)屏蔽HA的阻抗效果以实现ECs和SMCs的有序共培养(SMCs-ColⅣ-ECs)两种血管内皮细胞和平滑肌细胞的共培养模型，并在此基础上初步实现了Ti金属表面血管仿生内膜构建，同时对该内膜的生物学功能进行了评价。首先，研究了P10/40(HA条纹宽度10μm;裸露的碱活化Ti条纹宽度40μm)、P25/25(HA条纹宽度25μm;裸露的碱活化Ti条纹宽度25μm)、P40/10(HA条纹宽度40μm;裸露的碱活化Ti条纹宽度10μm)三种微图形尺寸对内皮细胞的形态、增殖、功能性因子分泌和抗凝血功能的影响，筛选出最适合脐静脉内皮细胞生理功能发挥的微图形尺寸。其次，在此基础上构建了“SMCs-HAa-ECs”和“SMCs-ColⅣ-ECs”两种血管内皮细胞和平滑肌细胞的共培养模型。通过对比两个模型中内皮细胞形态、数量、抗凝血因子分泌功能、抗凝血功能以及抗切应力功能，筛选出更适合Ti基底血管仿生内膜的共培养模型。最后，在前一步筛选的基础上通过对平滑肌细胞初始种植密度的优化，实现了Ti表面血管仿生内膜的初步构建，并对构建的仿生内膜进行了功能评价。综合利用扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、水接触角分析、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫荧光染色分析等方法对Ti表面透明质酸微图形的物化性能和稳定性进行了表征。运用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫荧光染色分析方法对内皮细胞的形态、数量和分泌功能进行了评价，尤其是运用双染方法观察共培养体系中内皮细胞和平滑肌细胞的形态和行为。运用细胞形态测量和计算软件(ImageJ)统计出内皮细胞的形态指数。通过血小板粘附和激活实验、活化部分凝血酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)实验对内皮细胞抗凝血功能进行了评价。在流动腔装置内模拟人体主动脉血流剪切力对材料表面内皮细胞的抗剪切力功能进行了评价。
　　本文的另一个相关工作是结合Ti表面透明质酸微图形对内皮细胞的调控和脱细胞技术在Ti基底上构建了透明质酸微图形和内皮细胞外基质交错分泌的表面，并对该表面进行了纤维蛋白原变性、内皮祖细胞粘附与抗凝血功能、平滑肌细胞粘附和巨噬细胞粘附等生物相容性评价。
　　全文主要结果如下:
　　1、透明质酸微图形制备到Ti基底表面，该二维微图形具备较好的结构稳定性和功能稳定性。P10/40、P25/25、P40/10三个尺寸的微图形中P25/25更适合内皮细胞生理功能的发挥，包括形态仿生、功能性因子的分泌及抗凝血功能等。
　　2、透明质酸微图形表面本身的血液相容性并不理想，但是通过微图形调控内皮细胞形态和细胞外基质的合成，再结合脱细胞技术可获得图形化分布的内皮细胞外基质。初步生物学评价结果显示，该细胞外基质表面具有较好的抑制纤维蛋白原变性功能、促内皮祖细胞粘附、有序分布和抗凝血功能，抑制平滑肌细胞粘附和促进平滑肌细胞表型收缩功能，以及抑制巨噬细胞粘附的功能。
　　3、通过透明质酸酶的加入可改变透明质酸阻抗细胞粘附的作用，实现了“SMCs-HAa-ECs”共培养体系的构建;利用ColⅣ的引入屏蔽透明质酸对内皮细胞的阻抗作用，实现了“SMCs-ColⅣ-ECs”共培养体系的构建;通过两套模型中内皮细胞抗凝血因子的分泌、抗凝血功能、抑制平滑肌细胞增生功能和抗流体剪切力功能的综合比较，发现“SMCs-ColⅣ-ECs”共培养模型具有更大的生物学优势。
　　4.在“SMCs-ColⅣ-ECs”共培养模型的基础上，利用内皮细胞和平滑肌细胞的初始种植密度差(1×105 cells/ml∶2.5×104 cells/ml)实现了Ti基底表面血管仿生内膜的初步构建，初步的生物学和力学评价结果显示，该仿生内膜与材料表面单独培养内皮细胞相比，具有形成血管仿生内膜较快、抗凝血因子分泌多、抗流体剪切力能力强等优势。为后续无机材料表面仿生内膜的优化提供了重要的实验基础。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 心血管植入材料表面内皮化研究进展

1．2．1 体内内皮化

1．2．2 体外内皮化

1．3 心血管体系多细胞共培养研究进展

1．3．1 血管内皮／平滑肌细胞共培养的研究

1．3．2 血管内皮／成纤维细胞共培养的研究

1．4 材料表面软图形制备技术概述

1．4．1 毛细力刻蚀

1．4．2 转移微模塑

1．4．3 微接触印刷

1．4．4 毛细微模塑

1．5 材料表面微图形调控细胞的研究现状

1．5．1 微图形对单种细胞调控的研究

1．5．2 微图形对多种细胞调控的研究

1．6 血管仿生内膜功能评价技术概述

1．6．1 血管仿生内膜完整性评价

1．6．2 功能性因子释放评价

1．6．3 内皮细胞形态指数评价

1．6．4 材料表面内皮细胞抗流体切应力功能评价

1．7 课题的提出、研究内容和技术路线

1．7．1 课题的提出

1．7．2 研究内容

1．7．3 技术路线

1．8 研究意义和目的

1．8．1 研究意义

1．8．2 研究目的

1．9 本课题的来源

第2章 Ti表面HA微图形的制备及其对内皮细胞的调控

2．1 引言

2．2 实验方法与内容

2．2．1 样品制备

2．2．2 表面表征

2．2．3 HA微图形对人血管内皮细胞的调控

2．2．4 数据统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 PDMS印章表面微图形表征

2．3．2 HA微图形物化性能分析

2．3．3 HA微图形结构及功能稳定性分析

2．3．4 不同尺寸HA微图形对人脐静脉内皮细胞的调控作用

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 HA微图形调控内皮细胞外基质的制备

3．1 引言

3．2 实验方法与内容

3．2．1 样品制备

3．2．2 血液相容性实验

3．2．3 有序分布的内皮细胞培养及脱细胞实验

3．2．4 数据统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 TiOH／HAP表面的血液相容性评价

3．3．2 TiOH／HAP表面ECs培养及脱细胞实验

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 图形化表面内皮细胞和平滑肌细胞的共培养

4．1 引言

4．2 实验方法与内容

4．2．1 样品制备

4．2．2 图形化共培养模型的建立

4．2．3 抗凝血因子检测实验

4．2．4 血液相容性实验

4．2．5 内皮细胞抑制增生评价

4．2．6 内皮细胞抗剪切力评价

4．2．7 数据统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 HA微图形表面SMCs形态及数量

4．3．2 HA微图形表面共培养细胞形态及数量

4．3．3 内皮细胞抗凝血因子的释放

4．3．4 血液相容性实验

4．3．5 抑制平滑肌过度增殖评价

4．3．6 流体切应力下细胞存留计算结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 TiOH／HAP表面血管仿生内膜的构建

5．1 引言

5．2 实验方法与内容

5．2．1 试剂和样品制备

5．2．2 血管内皮细胞及平滑肌细胞培养

5．2．3 平滑肌细胞初始种植浓度筛选

5．2．4 材料表面血管仿生内膜的初步构建

5．2．5 内皮细胞因子的检测

5．2．6 血管仿生内膜抗剪切力功能评价

5．2．7 统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 平滑肌细胞初始种植浓度筛选结果

5．3．2 金属钛表面血管仿生内膜的构建

5．3．3 内皮细胞抗凝血因子的释放与表达

5．3．4 仿生内膜抗流体剪切力能力评价

5．4 讨论

5．5 本章小结

结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及科研成果