RGD接枝改性复合水凝胶的制备及其基于低强度脉冲超声刺激的细胞分化研究

摘要

骨组织工程研究为三维支架的植入提供了一种潜在的方法。然而，在三维支架植入骨再生方面仍然存在一些挑战，包括创建结构和力学性能与自然骨相匹配的再生骨组织，以及成功实现支架与宿主骨的整合。其中，新骨形成和血管形成的程度被认为是骨组织工程临床应用的关键因素。水凝胶的含水量丰富，与人体组织极为相似，可用作组织工程支架材料。然而，水凝胶的亲水性表面不利于蛋白质的吸附，不利于粘附和细胞的生长，从而不利于新骨和血管化的形成，因此利用胺基与醛基之间的希夫碱反应将RGD接枝在多糖上对其表面亲水性进行改性。本研究使用RGD接枝氧化海藻酸钠/N-琥珀酰壳聚糖(RGD-OSA/NSC)复合水凝胶为基体材料，以低强度脉冲超声波(LIPUS)作为机械刺激的方法以期实现高水平的血管形成和新骨形成。为了评价LIPUS作用下复合水凝胶材料的血管化能力和成骨的性能，我们进行了较系统的体外成骨诱导和内皮诱导实验研究。结果显示RGD-OSA/NSC复合水凝胶在细胞粘附，增殖以及分化等方面表现出良好的生物学性能。MTT细胞活性分析表明，LIPUS与RGD共同作用实验组细胞的总数量最多，成骨诱导中ALP活性/染色和矿化结节以及内皮诱导中免疫染色检测实验中，比较LIPUS-RGD-OSA/NCS实验组与Control-RGD-OSA/NCS实验组及LIPUS-OSA/NCS实验组，发现前者的阳性率均高于后两者之和，表明LIPUS和RGD在促进hMSCs的增殖和分化过程中有协同作用。这些结果表明同时使用RGD修饰和LIPUS可能为骨组织工程支架植入过程中新骨形成和血管形成中提供一种有效地方法。

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论文说明

摘要

第1章 绪论

1．1 前言

1．2 骨组织工程支架

1．2．1 组织工程概述

1．2．2 骨组织工程支架分类

1．2．3 骨组织工程支架研究面临的主要问题

1．3 水凝胶

1．3．1 水凝胶的分类

1．3．2 水凝胶的改性及应用

1．3．3 海藻酸钠

1．3．4 壳聚糖

1．4 干细胞

1．4．1 干细胞特性

1．4．2 干细胞分类

1．4．3 间充质干细胞

1．4．4 骨髓间充质干细胞

1．5 低强度脉冲超声

1．5．1 低强度脉冲超声概述

1．5．2 超声波在组织工程上应用的可能性

1．6 本文研究目的及意义、主要内容与创新点

1．6．1 本文研究目的及意义

1．6．2 本文主要研究内容

1．6．3 本文研究创新点

第2章 RGD接枝复合水凝胶的制备

2．1 前言

2．2 实验材料及设备

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器及设备

2．3 RGD接枝复合水凝胶的制备

2．3．1 氧化海藻酸钠的制备

2．3．2 RGD接枝氧化海藻酸钠的制备

2．3．3 N-琥珀酰壳聚糖的制备

2．3．4 RGD接枝复合水凝胶的制备

2．4 RGD接枝复合水凝胶的表征

2．4．1 RGD-氧化海藻酸钠的表征

2．4．2 N-琥珀酰壳聚糖的表征

2．4．3 RGD接枝复合水凝胶的表征

2．5 数据统计学意义

2．6 实验结果分析

2．6．1 RGD接枝海藻酸钠的合成机理

2．6．2 RGD接枝海藻酸钠的红外光谱分析

2．6．3 RGD接枝海藻酸钠的接触角分析

2．6．4 N-琥珀酰壳聚糖合成机制

2．6．5 NSC的红外光谱分析

3．5．6 N-琥珀酰壳聚糖溶解性分析

2．6．7 复合水凝胶的合成机理

2．6．8 复合水凝胶的红外光谱分析

2．6．9 体外溶胀-降解实验

2．6．10 体外BSA缓释实验

2．7 本章小结

第3章 低强度脉冲超声刺激下对RGD接枝复合水凝胶的生物学评价

3．1 前言

3．2 实验材料及设备

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验设备

3．3 细胞培养

3．3．1 细胞复苏

3．3．2 细胞传代培养

3．3．3 细胞接种

3．4 生物学表征

3．4．1 内皮细胞检测

3．4．2 成骨细胞检测

3．5 实验结果分析

3．5．1 内皮细胞培养

3．5．2 成骨细胞培养

3．6 本章小结

第4章 低强度脉冲超声刺激下RGD接枝复合水凝胶诱导干细胞多向分化

4．1 前言

4．2 实验材料及设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验设备

4．3 骨髓间充质干细胞的培养与诱导分化

4．3．1 细胞分离与纯化

4．3．2 细胞传代培养

4．3．3 细胞活性检测

4．3．4 细胞培养与诱导分化

4．4 生物学表征

4．4．1 体外内皮分化检测

4．4．2 体外成骨分化检测

4．5 数据统计学意义

4．6 实验结果分析

4．6．1 内皮诱导分化

4．6．2 成骨诱导分化

4．7 本章小结

结论

展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文及科研成果