钛表面接权RGD及装载BMP的仿细胞外间质聚多糖自组装膜制备与表征

摘要

种植体材料表面的良好的生物相容性是种植体与骨形成良好结合的前提和关键。通常采用种植体材料表面构建生物活性物质涂层的方法，即将对细胞的增殖、诱导分化有促进作用的特定多肽、蛋白质、酶和聚多糖等固定于植入材料表面，制备仿细胞外间质活性涂层，来提高材料表面的生物活性。本研究主要采用层层组装技术，在钛表面构筑仿细胞外基质活性涂层，将促细胞粘附的RGD序列和促细胞分化的骨生长因子BMP引入涂层中，从而提高钛表面的生物相容性。研究分为以下三个部分:
　　首先在纯钛表面构建降解稳定的氧化海藻酸钠/壳聚糖交联自组装膜。纯钛表面先通过多巴胺处理，得到富含氨基的基底。将海藻酸钠经高碘酸钠氧化成多醛基的氧化海藻酸钠(O-Alg)，选取带负电的O-Alg和带正电的壳聚糖(Chi)通过层层自组装的方法在多巴胺处理后的Ti基底制备OALg/Chi多层膜结构(PEM)，改性后O-Alg与Chi的自组装膜间既存在静电吸附也有醛基和氨基共价结合后的交联作用。通过在溶菌酶溶液中进行降解性测试，结果表面实交联PEM与Alg/Chi相比具有更好的稳定性。通过骨髓间充质干细胞(BMSC)培养，验证聚多糖组装膜能够促进细胞生长。
　　其次，构建接枝RGD的氧化海藻酸钠/壳聚糖交联自组装膜。主要利用氨基与醛基反应，将RGD序列(包括GRGDS和RGD)通过共价结合的方式引入到氧化海藻酸钠结构中，利用自组装的方法构建接枝RGD序列的OAlg/Chi多层膜。体外BMSC培养，结果显示RGD序列的引入显著促进了骨髓间充质干细胞的粘附增殖，并且GRGDS比RGD显示出更好的促细胞粘附增殖能力。
　　最后，构建接枝RGD的和包裹BMP氧化海藻酸钠/壳聚糖交联自组装膜，形成仿细胞外基质层。首先将BMP-2包埋于用去溶剂法制得的BSA/Chi纳米颗粒中。然后将纳米颗粒与GRGDS-OAlg、 Chi在Ti表面构建自组装膜，颗粒上的氨基能与OAlg醛基发生共价反应使载因子颗粒稳固在材料表面，因子的释放率由纳米颗粒的在自组装膜上的位置，由膜层的水解及颗粒的降解多个因素控制，从而达到缓释的目的。通过模型蛋白检测释放曲线，证明了自组装颗粒/膜结构对因子的释放有很好的缓释效果。通过在材料表面BMSC的培养，证实接枝GRGDS装载BMP-2的自组装仿生涂层Ti-PEM-GRGDS-BMP既促进细胞黏附增值还能诱导向成骨分化，对提高材料的生物活性、提高材料与骨组织整合的效果起到积极作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 钛的生物学特性及应用

1．2 钛表面的物理化学改性

1．3 医用材料表面生物化改性

1．4 壳聚糖的性质及其生物材料中的运用

1．4．1 壳聚糖的性质

1．4．2 壳聚糖在生物材料中的运用

1．5 海藻酸钠的性质及应用

1．5．1 海藻酸钠的性质

1．5．2 海藻酸钠在生物医学材料中的应用

1．6 RGD性质及应用

1．6．1 RGD性质

1．6．2 RGD在生物材料表面的固定

1．7 BMP的性质及应用

1．7．1 BMP的性质

1．7．2 BMP的装载

1．8 层层自组装法

1．9 研究目的及内容

1．9．1 研究目的

1．9．2 研究内容

1．10 技术路线

第二章 层层自组装法制备OAlg／Chi多层膜

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 主要仪器及试剂

2．3 实验步骤

2．3．1 钛表面预处理

2．3．2 海藻酸钠的氧化

2．3．3 聚多糖溶液的配置

2．3．4 钛表面制备自组装膜

2．4 自组装膜的结构表征

2．4．1 盐酸羟胺-电位滴定法测定氧化海藻酸钠上的醛基浓度

2．4．2 红外

2．4．3 接触角测试

2．4．4 交联和非交联膜的降解

2．4．5 原代骨髓间充质干细胞的分离培养

2．4．6 Alamar Blue测试

2．4．7 荧光染色

2．5 结果与分析

2．5．1 聚多糖自组装膜的物理表征

2．5．2 体外细胞培养

2．5．3 讨论

2．6 小结

第三章 层层自组装法制备接枝RGD的自组装膜

3．1 引言

3．2 主要仪器及试剂

3．3 实验步骤

3．3．1 钛表面预处理

3．3．2 氧化海藻酸钠接枝多肽

3．3．3 层层自组装的方式制备接枝不同类型肽的多层膜结构

3．4 接枝多肽的自组装膜的表征

3．4．1 RGD在自组装膜上的分布

3．4．2 核磁共振

3．4．3 荧光分光光度计检测样品表面多肽浓度

3．4．4 体外细胞培养

3．5 结果与分析

3．5．1 RGD在自组装膜上的分布

3．5．2 核磁共振

3．5．3 荧光分光光度计检测样品表面多肽浓度

3．5．4 RGD序列对细胞行为的影响

3．5．5 讨论

3．6 小结

第四章 层层自组装法制备接枝RGD和载BMP的仿细胞外间质活性涂层

4．1 引言

4．2 主要试剂

4．3 实验步骤

4．3．1 钛表面预处理

4．3．2 载BMP-2的BSA／Chi纳米颗粒的制备

4．3．3 钛表面含BMP／RGD复合涂层的制备

4．3．4 激光共聚焦显微镜观察膜的构成

4．3．5 接触角测试

4．3．6 BMP在自组装结构中的释放实验

4．3．7 生物学评价

4．3．8 统计学分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 颗粒与自组装膜的物理表征

4．4．2 钛表面NP-PEM-LbL活性膜对蛋白的释放实验

4．4．3 接枝RGD与载BMP的自组装膜对细胞行为的影响

4．4．4 讨论

4．5 小结

结论

缩略词

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文