决明种子转录组学分析及胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与功能研究

摘要

豆科一年生植物决明(Cassia obtusifolia)中含有蒽醌、黄酮、苯丙酸、类胡萝卜素、类脂、萜类等多种有效活性成分，具有清热明目、降血压、降血脂、保肝及抑菌等多种生理活性，还含有胰蛋白酶抑制剂等生物活性大分子，胰蛋白酶抑制剂具有抗虫效应和潜在的抗肿瘤和抗病毒活性。目前仍有很多成分合成困难，因此研究决明子活性成分相关基因对于其生物合成具有重要意义。由于目前缺乏基因组数据，要发掘这些基因，转录组测序是一个合理的选择。本文的主要工作就是通过转录组测序，发掘这些活性成分相关的关键基因和代谢通路，并对相关基因进行分子克隆和表达分析，以为后期研究决明活性成分的生物合成和转基因植株的构建奠定坚实的基础。本文的主要结果如下:
　　1)首次对决明种子进行转录组测序，获得了40102个组装的Unigene，其中85％在公共数据库中找到同源基因。Unigene基于GO、COG和KEGG数据库进行了功能分类和注释。在注释的基础上筛选了大量与蒽醌、黄酮、萜类、脂类等生物活性成分相关的基因，并构建了相关的代谢通路。该结果为研究决明子生物活性成分的生物合成途径和调控机制，提高决明子的药用价值奠定基础。
　　2)首次进行决明定量PCR内参基因的选择与评价，筛选了在不同组织和不同胁迫条件下的合适内参基因。基于15个候选内参基因进行进行筛选和评价，结果发现EF1α2、CYP1和ACT2是筛选的最稳定的内参基因，EF1α2/CYP1是最稳定的内参组合，为后期的决明子相关基因的表达分析提供一个可靠的均一化标准。
　　3)克隆了一个新的胰蛋白酶抑制剂基因CoTI1，进行了结构建模、原核表达和功能鉴定。CoTI1属于Kunitz胰蛋白酶抑制剂，显示了对胰蛋白酶和棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾中肠蛋白酶液显著地抑制作用。CoTI1由11个β-折叠和12个loop组成，含有一个二硫键，可能与其结构稳定性相关。分子对接发现CoTI1的Arg86插入到胰蛋白酶的活性口袋中与关键残基Asp189作用，从而特异性地抑制其活性。Leu84和Thr88在位于口袋出口，对于抑制胰蛋白酶亦起到一定作用。为了验证这一结果，构建了这三个氨基酸的突变体蛋白，结果显示突变体丧失了大部分抑制作用，说明了这三个氨基酸的重要作用。CoTI1在盐胁迫、干旱条件下均呈现出上调趋势，在ABA条件下先上调，之后又呈现下降趋势。说明CoTI1可能在非生物胁迫中发挥了重要作用。该结果为胰蛋白酶抑制剂的分子机制和抗虫研究奠定基础。
　　4)克隆了一个新的莽草酸激酶基因CoSK，进行了序列分析、结构建模和组织差异表达模式分析。CoSK与SK高度同源，并含有SK活性位点。CoSK可能定位到不同的质体中发挥作用。CoSK结构呈现α-β-α折叠模式，由中间5个β-折叠和12个α-螺旋包围组成。根据分子对接，与ATP作用的Lys118/Arg223和与莽草酸作用的Asp137可能是催化的关键残基。CoSK不能通过二硫键形成二聚体，推测在高温条件下结构可能不稳定。CoSK在根、叶、愈伤组织中优势表达，而在茎、果荚、种子中表达量较低。在种子中表达量过低可能与生物活性成分或其中间体的组织转运相关。CoSK在根中优势表达暗示其在根的生理过程中发挥某种重要作用。
　　5)根据决明转录组克隆了一个新的巴豆酰辅酶A羧化酶基因MCCase，进行了序列分析以及组织差异表达。MCCase可能定位于线粒体或细胞质中。MCCase上有一个保守的功能结构域B，与乙酰CoA羧化酶显示出较高的相似性，并在该结构域内发现了4个高度保守的氨基酸基序，可能在催化过程中发挥关键作用。MCCase在不同组织中存在差异表达，MCCase在种子中的表达量低可能与决明种子中的亮氨酸含量很高而MCCase在亮氨酸分解代谢途径中发挥作用有关。在根与胚轴中显示出高表达，在其它组织中表达量低，可能与光和糖类抑制MCCase的表达有关。该结果为解析决明子氨基酸代谢途径和提高决明子的营养价值奠定基础。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 决明的生物学特性

1．2 决明子的药理学作用

1．2．1 降血脂作用

1．2．2 降压作用

1．2．3 保肝作用

1．2．4 抑菌作用

1．2．5 对免疫系统作用

1．2．6 明目作用

1．2．7 其它作用

1．3 决明的生物活性成分

1．3．1 蒽醌

1．3．2 黄酮类

1．3．3 蛋白质和氨基酸

1．3．4 脂肪和脂肪酸

1．3．5 胰蛋白酶抑制剂

1．3．6 其它成分

1．4 决明的生物活性成分相关基因

1．5 转录组测序

1．6 本文的研究目的和意义

第2章 决明种子转录组学分析

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 决明种子RNA的提取

2．1．3 转录组测序

2．1．4 序列组装

2．1．5 基因表达分析

2．1．6 基因功能注释、GO分类和代谢路径分析

2．1．7 SSR检测与引物设计

2．2 结果与讨论

2．2．1 决明种子RNA提取

2．2．2 决明种子转录组组装

2．2．3 基于对公共数据库检索的功能注释

2．2．4 决明转录组中蒽醌生物合成及调控相关基因

2．2．5 萜类生物合成基因

2．2．6 黄酮类化合物生物合成基因

2．2．7 脂类生物合成相关基因

2．2．8 脂转移蛋白

2．2．9 SSR

2．4 本章小结

第3章 决明定量PCR内参基因的选择与评价

3．1 材料与方法

3．1．1 植物组织的准备

3．1．2 生长激素和非生物胁迫

3．1．3 决明总RNA的提取与cDNA的制备

3．1．4 引物设计和标准曲线分析

3．1．5 qPCR扩增

3．1．6 决明候选内参基因稳定性分析

3．1．7 WRKY基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达水平分析

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA的提取

3．2．2 候选内参基因的选择和引物设计

3．2．3 决明内参候选基因的引物特异性与扩增效率

3．2．4 决明内参基因的初步筛选

3．2．5 决明内参候选基因的表达谱

3．2．6 内参候选基因表达稳定性分析

3．2．7 WRKY基因在不同决明组织以及不同胁迫条件下的表达水平分析

3．3 本章小结

第4章 决明胰蛋白酶抑制剂基因CoTI1的克隆、结构建模及功能鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 CoTI1的3’RACE

4．1．2 CoTI1 CDS全长克隆

4．1．3 CoTI1序列分析与分子建模

4．1．4 CoTI1原核表达载体的构建

4．1．5 CoTI1原核表达

4．1．6 CoTI1蛋白纯化

4．1．7 CoTI1活性检测

4．1．8 CoTI1定点突变

4．1．9 CbTI1表达模式分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 CoTI1 cDNA的克隆

4．2．2 CoTI1氨基酸序列分析

4．2．3 CoTI1序列比对分析

4．2．4 CoTI1系统发育分析

4．2．5 CoTI1的结构建模

4．2．6 CoTI1与胰蛋白酶的相互作用分析

4．2．7 CoTI1原核表达载体的构建

4．2．8 CoTI1原核表达

4．2．9 CoTI1蛋白纯化

4．2．10 CoTI1原核表达蛋白的活性检测

4．2．11 CoTI1的定点突变

4．2．12 CoTI1的表达模式分析

4．3 本章小结

第5章 决明莽草酸激酶基因CoSK的克隆、结构建模和表达模式

5．1 材料与方法

5．1．1 CoSK的3’RACE

5．1．2 CoKS的5’RACE

5．1．3 CoSK的CDS全长克隆

5．1．4 CoSK序列分析与分子建模

5．1．5 CoSK表达模式分析

5．2 结果与讨论

5．2．1 CoSK的克隆和序列分析

5．2．2 CoSK氨基酸序列分析

5．2．3 CoSK系统发育分析

5．2．4 CoSK序列比对分析

5．2．5 CoSK的转运肽和亚细胞定位

5．2．6 CoSK分子建模

5．2．7 CoSK的不稳定性

5．2．8 CoSK和底物的相互作用分析

5．2．9 CoSK可能的催化机制

5．2．10 CoSK的组织表达模式

5．2．11 CoSK下游代谢产物的转运

5．3 本章小结

第6章 决明巴豆酰辅酶A羧化酶基因MCCase的克隆、序列分析和表达模式

6．1 材料与方法

6．1．1 决明MCCase的3’RACE

6．1．2 决明MCCase的5’RACE

6．1．3 决明MCCase的CDS全长克隆

6．1．4 决明MCCase的序列分析

6．1．5 决明MCCase的组织差异表达分析

6．2 结果与讨论

6．2．1 决明MCCase cDNA的克隆

6．2．2 决明MCCase氨基酸序列分析

6．2．3 决明MCCase系统发育分析

6．2．4 决明MCCase序列比对分析

6．2．5 决明MCCase三级结构预测

6．2．6 决明MCCase组织差异表达分析

6．3 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及科研成果