含银敷料表征和银的释放及纳米银毒理学研究

摘要

纳米银(AgNPs)以其优异的广谱抗菌性能，被广泛应用于医疗、纺织、食品包装、化妆品、水质净化等领域。然而随着AgNPs产品大量的生产和使用，人体和环境暴露机会也逐渐增加，引起人们对其安全问题的关注。特别是含银敷料类产品在与患者接触的过程中，伴随着AgNPs及银离子（Ag+）的脱落和释放;且AgNPs本身作为释放源，会持续释放Ag+，对人体造成潜在的毒性风险。另一方面，AgNPs毒性也与人体暴露时间及AgNPs或Ag+的浓度有关。因此，含银敷料中银存在形式的表征和银释放与脱落的研究是评价其潜在风险的基础和关键步骤;并且有关AgNPs对小鼠成纤维细胞(L929)毒性机制仍不清楚。
　　本文以三种含银敷料（Anson、YB、AT敷料）作为研究对象，采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)观察敷料表面形貌及表面颗粒粒径分布，并采用X射线能量色散谱仪(EDS)分析表面元素分布;采用X射线光电子能谱(XPS)和X射线衍射(XRD)分析银颗粒的价态及晶体结构。表征结果显示Anson、YB和AT敷料表面均含有单质银(Ag0)。Anson敷料表面银颗粒粒径为5～25 nm，且存在化合态银（Ag+），其表面银颗粒为无定型银;YB敷料表面银颗粒粒径为5～10 nm，团聚银颗粒粒径为30～40 nm，其表面银颗粒为无定型银;AT敷料表面银颗粒粒径为30～45 nm，表面银颗粒为立方相银，根据Scherrer公式计算其表面银颗粒平均晶粒尺寸为30nm。
　　采用往复支架法研究敷料在水(H2O)和模拟体液(SBF)中银的释放，并通过原子吸收法（AAS）测量释放的银含量。由于SBF中氯离子(Cl-)与敷料中释放的Ag+结合生成氯化银(AgCl)颗粒，其粒径与AgNPs接近，难以区分。在高Cl-/Ag+浓度比的条件下，AgCl沉淀会形成可溶性的阴离子银络合物;因而首先研究在SBF中Ag+浓度对AgCl溶解性影响，解决AgCl颗粒干扰AgNPs分离的难题，最后通过超滤离心有效地区分AgNPs和Ag+;通过噻唑蓝比色法(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)法评价敷料浸提液对小鼠成纤维细胞(L929)毒性作用及与银表征与释放的相关性。AgCl溶解性结果显示在SBF中，当Ag+浓度低于0.5μg/mL时，AgCl的溶解性达到96.7％;进一步降低Ag+浓度，AgCl溶解性并没有显著性增加，故确定Ag+浓度0.5μg/mL为AgCl溶解性的阈值;体外释放实验显示Anson敷料在SBF中释放总银含量是在H2O中释放量的2倍以上;对敷料释放液总银测量后，若总银含量高于0.5μg/mL，则通过SBF稀释释放液，使总银含量低于0.5μg/mL;若低于0.5μg/mL，则直接通过10 kD滤膜离心后，分离AgNPs和Ag+。Anson、YB及AT敷料在SBF中总银释放量分别为12.40、49.23和59.90μg/cm2，AgNPs释放量分别为2.54、17.86和29.04μg/cm2;细胞毒性结果显示三种敷料浸提液均对L929细胞具有较强的细胞毒性，引起细胞内LDH释放，其中AT敷料细胞毒性最强，Anson敷料细胞毒性最弱，与总银及AgNPs释放量的结果具有相似性。
　　AgNPs毒理学实验中，采用TEM、动态光散射(DLS)、Zeta电位和紫外-可见吸收光谱(UV-vis)对AgNPs进行理化表征;采用MTT和LDH法评价AgNPs对L929细胞毒性作用;通过测量细胞内活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力和丙二醇(MDA)含量，研究AgNPs毒性机制。由于N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以有效的清除细胞内过多ROS，研究同时加入AgNPs和NAC对细胞活性和氧化应激影响。表征结果显示AgNPs为球形颗粒，且分布均匀，粒径在4～30 nm左右，其中5～10 nm占72％，平均粒径为7.25 nm;100μg/mLAgNPs在H2O中Zeta电位为-37.83±3.20 mV，特征峰在415nm左右。AgNPs可引起L929细胞活性降低和LDH释放量增加，且与浓度具有剂量-效应关系。在1.25μg/mL和1.50μg/mL浓度下，细胞活性分别为60％和36％，LDH释放率分别为28％和39％，细胞活性半抑制浓度(IC50)为1.38μg/mL; NAC处理细胞后，细胞活性上升与LDH释放量降低，并与对照组无显著性差异。进一步研究证实不同浓度AgNPs可引起L929细胞内水平ROS升高，SOD和GSH-px活力降低，MDA含量升高;当AgNPs浓度为1.00μg/mL和1.25μg/mL时，细胞内ROS含量为对照组1.8倍和2.4倍，SOD活力分别下降13.1％和24.3％，GSH-px活力分别下降21.5％和35.0％，MDA含量分别升高74.0％和106.6％，与对照组有显著性差异，且与AgNPs浓度具有剂量-效应关系，这些结果提示AgNPs引起细胞内氧化应激是AgNPs引起细胞毒性的主要机理。而AgNPs作用同时加入NAC抗氧化处理后，细胞内ROS、SOD、GSH-px和MDA恢复正常水平，与对照组无显著性差异，进一步证实ROS诱导的氧化应激是AgNPs引起细胞毒性的主要机制之一。
　　本研究主要研究了含银敷料的银的存在形式和银的体外释放方法，以及AgNPs毒性机制，其结果为含银敷料在临床上进行风险评估及合理有效的监管提供科学依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 纳米银特性及其抗菌性能

1．2 纳米银应用

1．3 纳米银生物安全性研究现状

1．3．1 纳米银体外细胞毒性

1．3．2 纳米银哺乳动物体内毒性

1．3．3 纳米银非哺乳动物毒性

1．4 纳米银毒性机理

1．5 纳米银毒性影响因素

1．5．1 粒径

1．5．2 表面涂层及表面电荷

1．5．3 银离子释放

1．6 本课题的研究目的、意义与内容

1．6．1 研究目的和意义

1．6．2 研究内容

第二章 含银敷料的表征

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 材料形貌表征

2．3．2 银颗粒价态分析

2．3．3 银颗粒成分分析

2．4 本章小结

第三章 含银敷料银体外释放及细胞毒性评价

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 敷料总银测量

3．2．2 敷料银的体外释放实验

3．2．3 敷料浸提液细胞毒性评价

3．2．4 统计学处理

3．3 结果与讨论

3．3．1 银元素标准曲线绘制

3．3．2 敷料中总银含量测定

3．3．3 Ag+浓度对AgCl溶解性的影晌

3．3．4 敷料中银的体外释放

3．3．5 敷料细胞毒性评价

3．4 本章小结

第四章 纳米银细胞毒性及氧化应激机制研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 AgNPs表征

4．2．2 AgNPs细胞毒性评价

4．2．3 ROS检测

4．2．4 氧化应激检测

4．2．5 统计学处理

4．3 结果与讨论

4．3．1 AgNPs表征

4．3．2 AgNPs细胞毒性评价

4．3．3 AgNPs氧化应激损伤

4．4 本章小结

结论

致谢

参考文献

参与课题及科研成果

索引