硝酸镓对血液来源表皮葡萄球菌PIA依赖的生物被膜形成的影响

摘要

表皮葡萄球菌是人体皮肤表面的常见共生菌，长期以来被考虑为污染菌，缺乏系统性的分子流行病学研究资料。近年来研究发现，绝大多数的婴儿菌血症和导管相关性血流感染由表皮葡萄球菌引起，临床菌株的主要特征是甲氧西林耐药和生物被膜形成。不同分子特征的表皮葡萄球菌的流行和致病能力存在差异。生物被膜形成是表皮葡萄球菌最重要的致病机制，研究临床菌株的分子特征和生物被膜形成机制对其预防和治疗具有重要意义。具有生物被膜形成能力的表皮葡萄球菌可引起慢性和反复感染，临床治疗十分困难，急需研究可用于表皮葡萄球菌感染治疗的药物，尤其是能有效杀灭包被于生物被膜内部细菌的药物。研究显示，治疗恶性高钙血症的硝酸镓具有抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的作用，我们推测其可能也具有抗表皮葡萄球菌生物被膜的作用。因此，本研究在探讨临床分离表皮葡萄球菌SCCmec和agr型别等分子生物学特征基础上，进一步分析其生物被膜形成能力，相关基因携带情况和生物被膜形成途径，同时探索硝酸镓在抗表皮葡萄球菌生物被膜形成中的作用，为其相关感染性疾病治疗的研究奠定基础。
　　我们采用激光共聚焦显微镜和半定量生物被膜粘附实验测定临床血液来源的86株表皮葡萄球菌的生物被膜形成情况，发现58株生物被膜阳性，占67.44％。结果提示绝大多数临床血液来源表皮葡萄球菌具有生物被膜形成能力。对表皮葡萄球菌耐药基因型和表型分析后，发现75株为mecA基因阳性，占87.21％;对于其中8种抗生素（庆大霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、红霉素、克林霉素、青霉素和苯唑西林），MRSE的耐药率高于MSSE的耐药率，这提示可能有其它耐药基因和mecA基因一起整合于SCCmec基因盒中，进而表现为耐药表型与mecA基因相关。
　　通过多重PCR对SCCmec和agr分型，探讨临床血液来源的表皮葡萄球菌的分子生物学特征，发现主要以Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型SCCmec型别和agrⅠ型为主，存在地域性差异，这提示分析表皮葡萄球菌SCCmec基因盒和agr多态性有利于了解表皮葡萄球菌的流行病学特征。通过分析分子生物学特征与耐药表型的关系，发现SCCmecⅢ型对复方新诺明、环丙沙星、庆大霉素、左旋氧氟沙星、利福平、红霉素和克林霉素共7种抗生素同时表现出很高的耐药率，可能是由于SCCmecⅢ型的片段较长，携带了多个耐药基因，这提示耐药表型与分子生物学特征具有相关性。借助PCR技术对临床菌株的生物被膜相关基因进行检测，发现各基因的携带情况不一，仅分析单个基因的携带与生物被膜形成不存在相关性，这可能是由于生物被膜形成过程复杂，存在多条合成途径。通过刚果红平板检测菌株胞间多糖粘附素(PIA)的生成情况，证实生物被膜形成除了PIA依赖途径外，还可能存在PIA非依赖途径。借助激光共聚焦显微镜分析两条途径形成的生物被膜的形态学差异，镜下可见含PIA的生物被膜为多层细菌粘附，这可能是PIA非依赖的生物被膜合成中，蛋白质虽然能替代PIA介导生物被膜形成，但不容易形成三维立体结构。
　　以PIA依赖的生物被膜形成临床菌株和表皮葡萄球菌标准菌株为研究对象，分析硝酸镓的抗菌作用和抗生物被膜作用。发现硝酸镓对临床菌株和实验室标准菌株的抗菌作用一致，MIC值均为312.50μmol/L。选用300μmol/L和1000μmol/L的硝酸镓分别作用于初期生物被膜和成熟期生物被膜，发现硝酸镓对PIA依赖的表皮葡萄球菌生物被膜形成有抑制作用，特别是初期生物被膜。研究还发现，硝酸镓对生物被膜抑制作用可能存在浓度依赖关系。
　　综上所述，血液来源表皮葡萄球菌主要为SCCmecⅠ，Ⅳ，Ⅴ型和agrⅠ型的MRSE，且普遍具有生物被膜形成能力。生物被膜形成包括PIA依赖和PIA非依赖两种途径，硝酸镓可抑制表皮葡萄球菌PIA依赖的生物被膜形成，有望成为治疗表皮葡萄球菌感染的新型药物。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 SE及其感染

1．2 表皮葡萄球菌的耐药

1．3 表皮葡萄球菌生物被膜形成

1．4 临床生物被膜相关感染的治疗

1．4．1 抑制细菌的黏附

1．4．2 破坏生物被膜

1．4．3 抗生素的应用

1．5 硝酸镓的抗生物被膜作用

第2章 表皮葡萄球菌生物被膜形成及耐药性分析

2．1 实验材料与方法

2．1．1 菌株

2．1．2 临床分离株的分子生物学鉴定

2．1．3 主要试剂

2．1．4 试剂的配置

2．1．5 主要仪器

2．1．6 细菌DNA提取

2．1．7 PCR检测mecA基因

2．1．8 生物被膜形成能力分析

2．1．9 PIA定性分析

2．1．10 生物被膜形态学特征分析

2．1．11 药敏试验

2．1．12 统计方法

2．2 实验结果

2．2．1 临床血液来源表皮葡萄球菌的分子鉴定

2．2．2 临床血液来源表皮葡萄球菌临床资料

2．2．3 生物被膜形成的半定量分析

2．2．4 PIA定性分析结果

2．2．5 生物被膜形态学特征

2．2．6 mecA耐药基因检测

2．2．7 药敏试验结果

2．2．8 mecA基因检测及耐药表型分析

2．2．9 MRSE与MSSE的耐药率的比较

2．2．10 生物被膜阳性与生物被膜阴性菌株耐药情况分析

2．3 讨论

第3章 血液来源表皮葡萄球菌的分子生物学特征

3．1 实验材料与方法

3．1．1 菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 引物系列

3．1．5 SCCmec分型

3．1．6 agr基因多态性分析

3．1．7 生物被膜相关基因分析

3．2 实验结果

3．2．1 75株MRSE的SCCmec分型结果

3．2．2 表皮葡萄球菌agr分型结果

3．2．3 生物被膜相关基因的检测

3．2．4 表皮葡萄球菌的分子特征

3．2．5 表皮葡萄球菌的分子特征与耐药表型分析

3．2．6 生物被膜形成与相关基因的关系

3．2．7 MRSE的生物被膜形成能力分析

3．3 讨论

第4章 硝酸镓抑制PIA依赖的表皮葡萄球菌生物被膜形成

4．1 实验材料与方法

4．1．1 菌株

4．1．2 试剂

4．1．3 试剂的配制

4．1．4 主要仪器

4．1．5 硝酸镓对表皮葡萄球菌最低抑菌浓度的检测

4．1．6 硝酸镓对PIA依赖的生物被膜的作用

4．1．7 硝酸镓抑制生物被膜形态学分析

4．1．8 统计学分析

4．2 结果

4．2．1 研究菌株的生物被膜形成测定

4．2．2 硝酸镓对表皮葡萄球菌的MIC结果

4．2．3 硝酸镓对PIA依赖生物被膜形成的抑制作用

4．2．4 硝酸镓抑制PIA依赖的生物被膜形成的CLSM图片

4．3 讨论

全文总结

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果