表皮葡萄球菌耐药特征及其PIA上游调控子与亚-MIC红霉素影响其生物膜形成的关系研究

摘要

目的：
　　本研究以sub-MIC ERY为干预因素，以临床分离不同ERY耐药表型的S.epidermidis菌株为研究对象，首先进行生物膜形成能力的检测和亚抑菌浓度ERY对其生物膜形成的影响，并进一步分析其与细菌ERY耐药特征的关系，同时考察菌株PIA合成、icaA基因的转录以及其上游调控因子sarA、ica及LuxS/AI-2群体感应系统的变化情况，以明确ERY耐药特征及PIA上游调控因子与sub-MIC ERY影响S.epidermidis菌株生物膜形成的可能关系。
　　方法：
　　第一部分 亚抑菌浓度红霉素对临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成的影响及其与细菌红霉素耐药表型的关系研究
　　1.1、对临床分离菌株最小抑菌浓度（MIC值）的测定
　　采用“标准琼脂平板倍比稀释法”，以标准菌株S.aureus ATCC29213TM作为质控菌株，结果判读参照“2010版实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)”的标准进行，测定96株临床分离S.epidermidis菌株的MIC值。
　　1.2、细菌生物膜形成的观察方法
　　采用结晶紫染色法观察1/4 MIC ERY对S.epidermidis菌株生物膜形成的影响并统计分析1/4 MIC ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜形成能力的改变与ERY耐药表型的相关性。
　　根据实验室前期研究结果和文献报道，课题设定临床分离S.epidermidis菌株的生物膜OD值≥2倍标准菌株S.epidermidis ATCC12228TM的生物膜OD值，则认为该菌株具有生物膜形成能力。1/4 MIC ERY对临床分离S.epidermidis菌株生物膜形成的影响分为诱导、抑制或者不受影响三种类型，其区分标准如下：t检验比较各菌株ERY组与TSB对照组的生物膜OD值是否存在统计学差异。如果p＜0.05且ERY组的OD值大于TSB组的OD值，则认为该菌株生物膜形成发生了诱导现象;如果p＜0.05且ERY组的OD值小于TSB组的OD值，则认为该菌株生物膜形成发生了抑制现象;如果p＞0.05，则认为该菌株生物膜形成未发生变化。
　　第二部分 临床分离表皮葡萄球菌大环内酯类耐药基因分布及1/4最小抑菌浓度红霉素作用下erm基因的转录表达研究
　　2.1、聚合酶链式反应法(PCR)鉴定临床分离菌株大环内酯类耐药基因
　　采用PCR法检测96株临床分离S.epidermidis菌株中ermA，ermB及ermC基因的分布情况，并对其中分布最广的ermC基因进行序列测定和同源性分析。
　　2.2、1/4最小抑菌浓度红霉素作用下实验菌株ermC基因转录表达水平的时间-效应考察
　　采用real time RT-PCR方法，考察与1/4 MIC ERY共同孵育0.5 h、2h、6h、12h和24 h，实验菌株SH04和SH10的ermC基因的转录表达水平受其影响的情况，分析ermC基因的转录表达水平变化与1/4 MIC ERY对实验菌株生物膜形成影响的可能关系。
　　2.3、ermC基因转录表达水平与生物膜形成能力的相关性分析
　　根据ermC基因转录表达的时间-效应实验结果，随机抽取生物膜形成受1/4 MICERY抑制、诱导和不受其影响三种表型的菌株各8-9株，采用real time RT-PCR方法，考察与1/4 MIC ERY共同孵育2h，各菌株ermC基因的转录表达情况，分析该因素与1/4 MIC ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜OD值与无ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜OD值的比率之间的可能关系。
　　结果：
　　第一部分 亚抑菌浓度红霉素对临床分离表皮葡萄球菌菌株生物膜形成的影响及其与细菌红霉素耐药表型的关系研究
　　1、临床分离表皮葡萄球菌菌株的红霉素耐药情况
　　96株临床分离S.epidermidis中，85株为ERY耐药(MIC≥8 mg/L)菌株，耐药率为88.5％。其中15株MIC值在8～128 mg/L范围内，70株MIC值≥128 mg/L。
　　2、1/4最小抑菌浓度红霉素对临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
　　结果显示，96株临床分离S.epidermidis菌株均可形成生物膜。生物膜形成受1/4 MICERY影响的菌株共27株，且都是ERY耐药菌株。其中4株生物膜形成发生了抑制现象(p＜0.05)，23株生物膜形成发生了诱导现象(p＜0.05)。生物膜诱导菌株中，18株的生物膜诱导程度在1.11-2.0倍之间，5株的生物膜诱导程度大于2倍。其余58株ERY耐药株及11株ERY敏感株的生物膜形成均未受1/4 MIC ERY的明显影响。统计学分析发现，1/4 MIC ERY对临床分离S.epidermidis ERY耐药株和敏感株生物膜形成的影响不同，差异有统计学意义(x2=4.861，p=0.031)，提示1/4 MIC ERY作用下，临床分离S.epidermidis菌株生物膜形成与菌株的ERY耐药表型相关。
　　3、体外诱导耐药结果及1/4最小抑菌浓度红霉素对诱导耐药前后菌株生物膜形成的影响
　　11株临床分离ERY敏感S.epidermidis菌株均被成功诱导成ERY耐药菌株，诱导耐药后的MIC值分布在16～256μg/ml范围。平行考察1/4 MIC ERY作用下，11株ERY敏感S.epidermidis菌株及其诱导耐药后菌株生物膜的形成情况，结果显示:诱导耐药后S.epidermidis菌株SH22、SH51和SH67的ERY组生物膜OD值与其对照组比较，明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05);诱导耐药后S.epidermidis菌株SH40、SH46、SH52和SH77的ERY组生物膜OD值与其对照组比较，明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。原11株ERY敏感S.epidermidis菌株ERY组生物膜OD值与其对照组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　第二部分 临床分离表皮葡萄球菌大环内酯类耐药基因分布及1/4最小抑菌浓度红霉素作用下erm基因的转录表达研究
　　1、96株临床分离表皮葡萄球菌ermA、ermB及ermC基因的分布情况
　　96株S.epidermidis菌株ermC基因的阳性扩增率为94.8％(91/96); ermA及ermB基因的阳性扩增率均为6.2％(6/96)。统计学分析结果提示，各基因的分布情况在生物膜形成不同影响类型临床分离S.epidermidis菌株之间无差异(p＞0.05)。其中ermC基因在生物膜形成发生抑制、诱导和不受影响的S.epidermidis菌株中分布率分别为:100％、95.7％和94.2％。将各菌株扩增出的ermC基因产物进行碱基序列测定，并将测得的碱基序列在Pubmed NCBI基因库中进行同源序列比对，结果各菌株测得的碱基序列与NCBI基因库中的同源序列比较，同源性达99％，未发现有意义的突变位点。
　　2、实验菌株ermC基因转录表达水平的时间-效应结果
　　对临床分离S.epidermidis菌株SH04和SH10 ermC基因的转录表达水平进行时间-效应考察发现:在0.5 h、2h和12 h时间点，生物膜抑制菌株SH04的ermC基因的转录表达发生明显抑制(p＜0.05);在6h时间点，该菌株ermC基因的转录表达发生明显诱导(p＜0.05);在24 h时间点，该菌株ermC基因的转录表达发生抑制，但与对照组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。在0.5 h、2h和6h时间点，生物膜诱导菌株SH10的ermC基因的转录表达发生显著诱导(p＜0.05);在12h和24 h时间点，该菌株ermC基因的转录表达均发生抑制，但孵育12h，ERY组ermC基因的转录表达与对照组比较，差异无统计学意义(p＞0.05);而孵育24 h，ERY组ermC基因的转录表达显著低于对照组(p＜0.05)。
　　结论：
　　1、1/4 MIC ERY对临床分离ERY耐药S.epidermidis菌株生物膜形成可产生诱导和抑制两种相反的作用。
　　2、ERY耐药表型与1/4 MIC ERY对S.epidermidis菌株生物膜形成的影响具有一定相关性。
　　3、ermC基因的转录表达水平可能与1/4 MIC ERY对S.epidermidis生物膜形成的影响具有相关关系。
　　4、对PIA及其上游调控因子LuxS/AI-2群体感应系统的影响，可能是1/4 MIC ERY影响临床分离S.epidermidis菌株生物膜形成的重要机制之一。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 sub-MIC ERY对临床分离表皮葡萄球菌菌株生物膜形成的影响及其与细菌ERY耐药表型的关系研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 临床分离表皮葡萄球菌大环内酯类耐药基因分布及1／4MIC ERY作用下ermC基因的转录表达研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 多聚糖细胞间粘附素PIA及其上游调控因子在1／4 MICERY影响临床分离表皮葡萄球菌菌株生物膜形成中的作用研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文讨论

全文结论

参考文献

文献综述 sub-MIC抗菌药物影响细菌生物膜形成的机制研究进展

研究生期间发表的与课题相关的论文及获奖情况

致谢