形貌可控纳米羟基磷灰石/海藻酸钠复合材料的3D打印研究

摘要

羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)由于良好的生物活性、生物相容性和骨传导性，已作为骨修复替代材料和整形外科材料广泛应用于临床。随着纳米技术的快速发展，纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatite，nano-HA)的制备和应用已引起了广泛关注。Nano-HA的形貌会影响其表面特性、生物活性和生物相容性等，若能有效调控nano-HA形貌，如针状、棒状、球状和片状等，将进一步拓展其在生物医学领域的应用。3D打印是目前制造业的热点之一，利用3D打印技术进行个性化定制骨修复体是骨组织工程的主要研究方向，但是微米级HA无法满足3D打印所要求的流动性和凝固性。机械活化是利用机械能诱发化学反应和诱导材料组织、结构和性能的变化，来制备新材料或对材料进行改性处理的方法。本论文采用不同有机模板、合成方法和机械活化处理，合成不同尺寸和形貌的nano-HA，并研究批量制备分散性较好的nano-HA，满足3D打印对nano-HA量的需求。采用海藻酸钠/nano-HA作为3D打印“墨水”，研究材料的流变学性能、溶胀性、力学性能及生物相容性。
　　本论文以无毒无刺激，具有双亲性和生物相容性的聚乙二醇(PEG)为模板之一，通过调节PEG浓度可调控HA颗粒尺寸，不同反应体系(滴定法和扩散法)可实现对HA颗粒形貌的调控。滴定法合成nano-HA呈棒状，扩散法合成nano-HA为球状，PEG浓度4.0 mM为较优模板浓度。机械活化过程中机械力使晶体产生缺陷，导致晶格畸变、晶体结晶度降低和晶粒细化，对湿法合成未经干燥的HA沉淀进行机械活化处理可实现批量制备针状和球状nano-HA。
　　阿仑膦酸钠(Alendronate sodium，ALN)是第三代双膦酸盐之一，广泛应用于临床骨质疏松等疾病的治疗，它与Ca2+之间有较强亲和性，对nano-HA的晶体生长和团聚具有一定抑制作用，在机械活化过程中加入ALN作为化学分散剂可使样品结晶度更低，且分散性更好。ALN作为另一种模板调控合成nano-HA，通过提高反应物浓度(摩尔级)，对模板法合成未经干燥的产物直接进行机械活化处理，并在机械活化过程中加入ALN，实现了批量制备分散性良好的nano-HA，初步揭示了机械活化及ALN在nano-HA合成中发挥的作用。机械活化与ALN协同作用合成的nano-HA尺寸均小于100nm(MA-HA和AMA-HA); ALN调控与机械活化单独作用均会使HA的结晶度降低，ALN与机械活化协同作用会进一步降低HA的结晶度。ALN不但作为化学分散剂调控nano- HA晶体的生长，且可作为骨质疏松等疾病的治疗药物载于nano-HA，提高nano-HA的生物学性能，ALN的体外释放分为三个阶段:初始突释阶段，随后的快速释放和最后的缓慢释放阶段;软件拟合结果显示Logistic模型对ALN释放曲线的拟合效果较好。
　　以nano-HA(机械活化处理后)和海藻酸钠为打印原料，结合海藻酸钠的流动性和交联特性及nano-HA可提高支架力学性能，通过3D打印构建与自然骨组成及结构相似的骨修复支架。流变仪测试结果显示复合水凝胶属于剪切稀化材料。溶胀性实验表明hydrogel15％HA样品在六种条件下质量变化均较其他三种样品缓慢，选择溶胀性最低的hydrogel15％HA复合材料进行3D打印研究。力学性能试验结果表明随nano-HA比例增加，3D打印水凝胶复合支架压缩模量和刚度越大。支架的微观形貌表征显示随nano-HA比例增加，支架孔隙减少，孔径变小;支架元素分布扫描证明nano-HA在水凝胶复合支架中均匀分布。
　　将模板法调控并经过机械活化处理的四种不同形貌nano-HA颗粒(针状、球状、棒状和不规则形状)与入骨肉瘤细胞(MG-63)共培养，细胞毒性检测结果显示共培养5d后加入ALN机械活化处理的样品(MA-HA)较其他样品细胞毒性降为0级，且其细胞相对增殖率(RGR，％)较其他四种样品更高，因此选择MA-HA样品作为3D打印原材料，此支架与MG-63共培养5d后，RGR(％)为110.4±5.2％，对MG-63增殖具有促进作用，说明该样品具有良好的细胞相容性。荧光染色结果显示细胞在hydrogel15％HA表面铺展良好，细胞形态呈梭形、三角形或多角形且伪足明显，hydrogel15％HA更适合MG-63细胞铺展和粘附。
　　本论文通过有机模板、合成方法和机械活化实现了批量制备不同形貌的nano-HA并用于3D打印，结合nano-HA与海藻酸钠解决了微米级HA在3D打印中无法兼顾流动性和凝固性的问题，体外细胞评价结果显示3D打印复合支架细胞相容性良好，有望应用于临床复杂骨缺损的修复。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 纳米羟基磷灰石

1．1．1 纳米羟基磷灰石的性质及应用

1．1．2 纳米羟基磷灰石的形貌对其生物学性能的影响

1．1．3 纳米羟基磷灰石的制备

1．2 磷酸钙基生物材料的3D打印

1．2．1 磷酸钙基生物材料的3D打印方法

1．2．2 磷酸钙基生物材料3D打印研究现状

1．3 海藻酸盐的研究

1．3．1 海藻酸盐的结构

1．3．2 海藻酸盐的性质及应用

1．4 聚乙二醇与阿仑膦酸钠的研究

1．4．1 聚乙二醇的结构、性质及应用

1．4．2 阿仑膦酸钠的结构、性质及应用

1．5 本论文问题的提出、研究目的及内容

1．5．1 本论文问题的提出

1．5．2 本论文的研究目的

1．5．3 本论文的研究内容

第二章 聚乙二醇调控合成不同形貌纳米羟基磷灰石

2．1 引言

2．2 材料与实验方法

2．2．1 实验试剂

2．2．2 滴定法样品制备

2．2．3 扩散法样品制备

2．2．4 样品机械活化

2．2．5 样品形貌表征

2．2．6 样品物相分析

2．2．7 样品结构分析

2．2．8 溶液电导率测量

2．2．9 样品粒径及Zeta电位测定

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 样品微观形貌

2．3．2 样品物相分析

2．3．3 样品红外结果分析

2．3．4 溶液电导率

2．3．5 样品Zeta电位测定结果

2．3．6 机械活化样品表征

2．4 本章小结

第三章 机械活化结合化学分散批量合成纳米羟基磷灰石

3．1 引言

3．2 材料与实验方法

3．2．1 实验试剂

3．2．2 样品制备

3．2．3 样品表征

3．2．4 阿仑膦酸钠的体外释放

3．2．5 统计学分析

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 样品微观形貌

3．3．2 样品物相分析

3．3．3 样品组成结构

3．3．4 样品Zeta电位分析

3．3．5 阿仑膦酸钠的体外释放

3．4 本章小结

第四章 纳米羟基磷灰石／海藻酸钠复合材料的3D打印

4．1 引言

4．2 材料与实验方法

4．2．1 实验试剂

4．2．2 水凝胶前体制备

4．2．3 3D生物打印系统

4．2．4 水凝胶前体的流变学性能

4．2．5 3D打印复合支架的溶胀性能

4．2．6 3D打印复合支架的力学性能

4．2．7 3D打印复合支架的微观形貌

4．2．8 3D打印复合支架的表面粗糙度

4．2．9 统计学分析

4．3 结果和讨论

4．3．1 水凝胶前体的流变学性能

4．3．2 3D打印复合支架的溶胀性

4．3．3 3D打印复合支架的力学性能

4．3．4 3D打印复合支架的微观形貌

4．3．5 3D打印复合支架的表面粗糙度

4．4 本章小结

第五章 不同形貌纳米羟基磷灰石及3D打印复合支架的生物相容性评价

5．1 引言

5．2 材料与实验方法

5．2．1 实验试剂

5．2．2 不同形貌nano-HA与MG-63共培养

5．2．3 3D打印复合支架与MG-63共培养

5．2．4 细胞毒性检测

5．2．5 细胞形态观察

5．2．6 统计学分析

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 不同形貌nano-HA细胞毒性检测

5．3．2 不同形貌nano-HA细胞共培养形态分析

5．3．3 3D打印复合支架的细胞毒性检测

5．3．4 3D打印复合支架细胞共培养形态分析

5．4 本章小结

结论

致谢

参考文献

参研课题及科研成果