VA修饰PEG-PCL纳米胶束载喜树碱选择性抑制活化态肝星状细胞糖酵解行为及小鼠肝纤维化的研究

摘要

活化态肝星状细胞(HSCs)在肝纤维化的治疗当中是关键的靶细胞，因为肝纤维化发展过程中细胞外基质(ECM)的沉积主要由活化态HSCs产生。因此逆转活化态HSCs的肌成纤维母细胞表型(myofibroblast, MF)对肝纤维化和肝炎的治疗有着重要的意义。喜树碱(CPT)可以抑制肿瘤细胞中缺氧因子HIF-1-α蛋白的活性;活化态HSCs细胞糖酵解代谢活动与其MF表型细胞的增殖紧密相关，本文通过实验发现低剂量CPT可以通过抑制HIF-1-α蛋白的表达从而抑制HSCs糖酵解代谢活动，进而抑制其活化态MF表型，有望成为一种新型治疗肝纤维化的药物。然而CPT难溶于水且其稳定性极差，作为裸药使用时极其容易被降解和清除，且降解产物毒性很大，因此在本论文中，本文构建一种视黄醇(Retinol，VA)偶联的两亲性嵌段聚合物材料，并制备成相应的胶束，对CPT进行物理包裹后在体内载送至肝脏并选择性靶向HSCs，以期抑制和改善小鼠肝纤维化从而获得一种新型治疗肝纤维化疾病的温和而有效的药物。
　　首先，本文合成偶联有靶向配体视黄醇的VA-PEG-PCL聚合物并制备成相应的纳米胶束，未接枝靶向配体的PEG-PCL聚合物设为对照。随后通过溶剂挥发法制备VA-PEG-PCL和PEG-PCL纳米胶束。通过核磁共振氢谱(1HNMR)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、动态光散射仪(DLS)以及透射电镜(TEM)对两种聚合物材料和自组装形成的纳米胶束理化性质进行研究，通过细胞毒性分析和溶血率测定来表征两种胶束的细胞相容性和血液相容性，用合成的聚合物制备载CPT胶束并对载药胶束进行粒径和体外药物释放行为研究。结果表明，合成的聚合物结构符合预期;制备的纳米胶束粒径较小且分布较窄，形态为规整球形;临界胶束浓度较小，使其能够在血液循环中保持稳定的胶束结构;两种胶束均具有良好的细胞和血液相容性;载CPT纳米胶束的药物释放性能稳定且具有一定的pH响应性。
　　体外实验中，本文研究载有尼罗红(Nile Red，NR)荧光分子的VA-PEG-PCL和PEG-PCL胶束在活化态HSC-T6细胞系、原代活化态HSCs和原代HCs中的细胞摄取行为，并采用一次性注射四氯化碳(CCl4)诱导急性肝损伤模型研究两种胶束所载送的NR在小鼠体内主要器官内分布。实验结果显示，与PEG-PCL胶束相比，活化态HSC-T6细胞系和原代活化态HSCs细胞对偶联VA的纳米胶束摄取显著增强。更重要的是，VA-PEG-PCL胶束在进入急性肝损伤小鼠体内后，较PEG-PCL胶束，大量聚集在受损肝部，表明VA-PEG-PCL纳米胶束不仅能够在体外选择性靶向HSCs，同样可选择性靶向肝纤维化小鼠肝脏中大量扩增的HSCs，进而把所载送的药物向肝纤维化小鼠肝脏进行靶向性输送和富集。
　　通过实验考察CPT药物对活化态HSCs细胞存活率、糖酵解活动和MF表型的影响，并进一步研究CPT裸药和载CPT胶束对原代HSCs糖酵解行为和MF表型的抑制效果。实验结果表明CPT裸药对HSC-T6细胞生长、糖酵解行为和MF表型具有抑制作用，且随着药物浓度的提高而逐渐增强;载CPT胶束对原代活化态HSCs基因水平的抑制作用也呈相同趋势，但因载药胶束的缓释作用抑制能力较CPT裸药降低，同时由于VA介导受体内吞作用，VA-PEG-PCL胶束较PEG-PCL胶束显示更强的抑制效果。
　　本文采用CCl4腹腔注射六周诱导小鼠慢性肝纤维化模型分析CPT裸药及载CPT胶束对肝纤维化小鼠肝脏的治疗效果。从生化水平、病理组织学、分子生物学进行检测和分析。实验结果表明，模型组小鼠肝脏组织中糖酵解代谢途径、MF表型标记基因、纤维化进程相关基因和蛋白水平显著增强，血清中酶活水平显著升高，组织石蜡切片染色显示，模型组小鼠肝脏组织结构存在较严重的破坏，存在较大程度的纤维组织增生间隔肝脏实质结构，提示造模成功。CPT裸药和PEG-PCL载CPT纳米胶束组较模型组相关基因和蛋白水平没有明显恢复，组织切片中纤维化结构特征几乎未有改善。仅有注射VA-PEG-PCL载送CPT药物组，能够保护CPT并定向输送至MF表型HSCs细胞，通过抑制肝脏组织中的HIF-1-α蛋白表达进而显著抑制其糖酵解代谢途径，逆转MF表型并显著抑制其异常增殖，减少胶原纤维沉积，显著减轻组织中纤维化结构，同时降低血清中酶活水平并恢复肝脏的正常功能。
　　采用CCl4诱导小鼠慢性肝纤维化模型探索本课题组前期合成材料叶酸靶向FA-PEG-PCL胶束载CPT对肝纤维化病变的治疗效果。实验结果显示，FA-PEG-PCL载CPT药物能够通过抑制HIF-1-α蛋白水平一定程度抑制病变肝脏中活化态HSCs糖酵解行为及异常增殖，一定程度减少胶原蛋白的分泌和细胞外基质的沉积，从而改善肝纤维化病变程度同时部分修复肝脏功能。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 肝纤维化概述

1．3 活化态肝星状细胞

1．4 喜树碱药物概述

1．5 药物传递纳米载体

1．6 靶向肝星状细胞常见配体

1．7 课题的提出和研究方案确定

第2章 聚合物材料的合成及表征

2．1 实验试剂与仪器

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 两亲性聚合物的合成

2．2．1 VA-PEG-COOH的合成

2．2．2 NH2-PCL的合成

2．2．3 PEG-PCL的合成

2．2．4 VA-PEG-PCL的合成

2．3 聚合物材料的表征

2．3．1 核磁共振氢谱(1H-NMR)

2．3．2 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

2．4 胶束的制备及表征

2．4．1 聚合物胶束的制备

2．4．2 胶束的粒径和形貌表征

2．4．3 临界胶束浓度(CMC)测定

2．5 结果与讨论

2．5．1 聚合物材料的表征

2．5．2 胶束的粒径和形貌观测

2．5．3 聚合物胶束的CMC测定

2．6 本章小结

第3章 两亲性聚合物胶束生物学表征

3．1 实验试剂与仪器

3．1．1 实验试剂

3．1．2 实验仪器

3．1．3 细胞模型及实验动物

3．2 空白胶束生物相容性评价

3．2．1 空白胶束细胞毒性实验

3．2．2 空白胶束溶血率实验

3．3 载尼罗红胶束制备及表征

3．3．1 载尼罗红胶束制备

3．3．2 载尼罗红胶束的细胞毒性实验

3．4 HSC-T6、原代HSCs及HCs细胞对载尼罗红胶束的吞噬研究

3．4．1 原代HSCs及原代HCs细胞的分离和培养

3．4．2 HSC-T6细胞吞噬载尼罗红胶束的荧光观察及流式细胞仪分析

3．4．3 大鼠原代HSCs和HCs细胞吞噬载NR胶束的荧光观察及流式分析

3．5 载尼罗红胶束体内靶向性研究

3．5．1 小鼠急性肝损伤模型造模及给药

3．5．2 QRT-PCR基因水平分析

3．5．3 Western Blot蛋白表达分析

3．5．4 组织学染色分析

3．5．5 尼罗红生物学分布

3．5．6 统计学分析

3．6 结果与讨论

3．6．1 空白胶束生物相容性考察

3．6．2 载尼罗红胶束的表征

3．6．3 载尼罗红胶束体外靶向性研究

3．6．4 小鼠急性肝损伤模型造模评价

3．6．5 载尼罗红胶束体内主要器官生物分布研究

3．7 本章小结

第4章 载喜树碱胶束对活化态肝星状细胞的生物学评价

4．1 实验材料

4．1．1 实验试剂

4．1．2 实验仪器

4．1．3 细胞模型

4．2 载喜树碱的两亲性聚合物胶束的制备及表征

4．2．1 载喜树碱胶束的制备

4．2．2 载喜树碱胶束的粒径及形貌考察

4．2．3 载喜树碱胶束的载药量及包封率

4．2．4 载喜树碱胶束的体外药物释放行为

4．3 喜树碱及载药胶束对HSC-T6细胞的细胞毒性、基因表达和蛋白水平影响

4．3．1 CPT及载CPT胶束对HSC-T6细胞毒性

4．3．2 CPT对HSC-T6细胞基因水平影响

4．3．3 CPT对HSC-T6细胞蛋白表达影响

4．4 喜树碱及载药胶束对原代HSCs细胞的基因水平影响

4．5 结果与讨论

4．5．1 载喜树碱胶束的表征

4．5．2 喜树碱对HSC-T6细胞作用

4．5．3 喜树碱及载药胶束对原代HSCs细胞的基因水平影响分析

4．6 本章小结

第5章 喜树碱及载药胶束对CCl4诱导慢性肝纤维化小鼠治疗效果研究

5．1 实验材料

5．1．1 实验试剂

5．1．2 实验仪器

5．1．3 实验动物

5．2 CCl4诱导小鼠慢性肝纤维化模型建立及实验安排

5．2．1 肝纤维化模型建立

5．2．2 动物分组及给药

5．2．3 解剖实验及样品收集

5．3 实验方法

5．3．1 基因水平分析

5．3．2 蛋白表达检测

5．3．3 免疫组化(IHC)分析

5．3．4 病理组织学分析

5．3．5 生化水平分析

5．3．6 统计学分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 各药物处理组抑制MF表型HSCs糖酵解行为

5．4．2 各药物处理组抑制MF表型HSCs增殖

5．4．3 各药物处理组抑制肝纤维化同时修复肝脏功能

5．5 本章小结

第6章 喜树碱及载喜树碱胶束(叶酸配体)对CCl4诱导慢性肝纤维化小鼠治疗效果研究

6．1 实验材料

6．1．1 实验试剂

6．1．2 实验仪器

6．1．3 实验动物

6．2 CCl4诱导小鼠慢性肝纤维化模型建立及实验安排

6．2．1 肝纤维化模型建立

6．2．2 动物分组及给药

6．2．3 解剖实验及样品收集

6．3 实验方法

6．4 结果与讨论

6．4．1 各药物处理组抑制MF-HSCs糖酵解行为及异常扩增

6．4．2 各药物处理组抑制肝纤维化及修复肝脏功能

6．5 本章小结

全文结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表论文

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