鱼类细胞中药物代谢酶体外诱导的研究

摘要

本论文的研究内容分为三个部分，第一部分是鱼类细胞药物代谢研究基础参数的确立；第二部分是鱼类细胞中药物代谢酶活性的诱导研究：第三部分是鱼类细胞中药物代谢酶表达的诱导研究。每部分各有两章，共六章，分别如下：1.鱼类细胞药物代谢能力基本指标的检测：细胞形态学观察表明SMMC7721细胞生长最为迅速，鱼类细胞生长速度相对较慢。利用Lowry比色法测定每107个细胞的总蛋白与微粒体蛋白含量。利用差示光谱法检测细胞中细胞色素P450和b5含量，结果表明，PCP、PSF、GCB、EPC、FHM、CO等细胞中细胞色素P450和b5含量极低，其他细胞P450和b5含量的大小顺序均为：SMMC7721＞GCL＞CIK＞PCK，实验初步认为SMMC7721、GCL、CIK、PCK具有较强代谢潜能。将细胞与相应组织所提取的细胞色素P450的含量进行比较，两者之间有一定的相关性，回归方程为Y=1.8298X+0.0198(R2=0.8827)。结果表明，体外培养细胞保留了体内细胞一定含量的P450，这为相应的药物代谢酶的潜在活性提供了物质基础。 2.鱼类细胞的生长特性及药物敏感性的研究：根据分别扫描的MTT、FMZ和酚红的吸收光谱，选取492nm作为FMZ的检测波长。在0.156×104～10×104cells/well间MTT检测的细胞数与OD值表现出显著的线性正相关，可见MTT检测的OD值能较好地反映活细胞密度。MTT的作用浓度及反应时间对OD值均有较大影响，根据实验结果在细胞MTT检测中，采用0.5mg/ml为MTT作用浓度，4h为反应时间。细胞接种量对细胞的生长速度有一定影响，根据实验结果后续研究中SMMC7721细胞选择2.5×104cells/ml，鱼类细胞统一选取105cells/ml为最初接种密度。以MTT检测法绘制细胞生长曲线，结果表明细胞在第0～1天处于潜伏期，在第1～4天处于对数生长期，第4天进入平台期，根据实验结果后续研究中细胞预培养1d，药物对细胞的作用时间不超过3d，少于3d则延长预培养时间。群体倍增时间和群体倍增水平的计算结果表明不同细胞增殖能力的大小顺序是SMMC7721＞PCK＞GCL＞CIK。以MTT法检测，Hill模型拟合，获得各种实验药物对不同细胞的半致死浓度IC50，IC50越小，细胞对该药越敏感。 3.鱼类细胞EROD活性的诱导研究：利用分子荧光分析法建立了测定EROD活性的方法，并研究了EROD催化底物反应时间。在此基础之上分别以Log-Normal、Gentox和Logistic模型拟合并分析比较了诱导剂TCDD、PCB、PB、BaP、3-MC、BNF对GCL细胞EROD酶活的剂量-效应曲线，结果表明Log-Normal模型能较好的拟合药酶诱导前升后降的钟形效应曲线，所得方程参数值p100和EC100可用于药物代谢酶的诱导研究；Gentox模型拟合度相对较低而且所得EC50参数值非生物学半效应浓度；而Logistic模型只能拟合曲线诱导上升部分而且EC50和p100与Log-Normal模型相比显著偏高。进一步研究诱导剂作用时间对剂量效应的影响，结果显示诱导剂TCDD对GCL细胞作用时间越长，EC100越大，p100越小，但在作用48h后即达到较大诱导效应，延长时间无显著增强。以TCDD研究不同细胞对诱导剂的敏感度和诱导潜力，结果发现GCL和CIK细胞中诱导剂的EC100显著低于PCK和SMMC7721细胞，而诱导倍数则是GCL和SMMC7721细胞显著高于CIK和PCK细胞。比较分析PAHs对细胞EROD诱导与活力抑制的关系，结果表明两者之间有较好的相关性，而且药物通过EROD诱导实验可以在极低浓度下显示对细胞生长的潜在毒性。 4.鱼类细胞恩诺沙星脱乙基酶活性的诱导研究：通过RP-HPLC法建立了细胞中恩诺沙星和环丙沙星的检测方法，方法回收率分别为98.10％±2.98％和94.61％±0.89％，日内变异系数分别为3.19％±1.17％和5.01％±1.86％，日间变异系数分别为3.63％±1.35％和5.59％±1.88％。在此基础上对恩诺沙星在细胞中的体外代谢进行了研究，结果显示药物RIF和PB的浓度分别在12.6μM和34.8μM时对ENR脱乙基酶具有最大的诱导倍数，分别为6.0和2.3；而ERM对ENR脱乙基酶具有抑制作用，EC50为20.3μM。RIF诱导组和对照组细胞中恩诺沙星代谢的药时曲线方程分别为Ct/Co=-0.0654Ln(t)+0.7342和Ct/Co=-0.0280Ln(t)+0.9300，半衰期(t1/2)分别为35.9h和4，672，210h，反应12h后ENR消除率分别为41.2％±3.4％和15.3％±4.2％，CIP转化率分别为78.9％±8.7％和51.8％±4.2％，实验结果表明RIF对ENR的脱乙基代谢具有显著的促进作用。根据Linewaver-Burk方程，RIF诱导组和对照组的酶促反应动力学方程分别为1/V=72.5530×1/[S]+1.4922和1/V=530.9800×1/[S]+3.5274。酶动力学参数表明，诱导组中的最大反应速率Vmax和内在清除率Clint均明显大于对照组，表明RIF诱导的酶催化效能较高。此外对照组米氏常数Km值是诱导组的17.3倍，表明RIF诱导的酶与底物的亲合力较高，酶促反应的强度较大。 5.草鱼CYP1A和ACT基因cDNA片断的克隆与鉴定：以Trizol法分别提取BNF诱导和对照处理草鱼的肝组织总RNA并合成cDNA第一链，以此为模板利用1对ACT特异性引物和8条6对CYP1A简并引物进行扩增，结果引物FO-RO在对照和诱导草鱼中均扩增得到预期ACTcDNA片断，而引物F4-R4在诱导草鱼中获得预期CYP1AcDNA产物。这两个cDNA片断分别进行克隆、测序和比对，BLAST结果表明草鱼ACTcDNA片断(800bp)与Genbank中已有序列(登录号M25013)同源性为99.1％，而推导的氨基酸序列同源性为99.2％；草鱼CYP1AcDNA片断(439bp)与鲤鱼同源性最高，为92.5％，而推导的氨基酸同源性为96.6％。通过GenBank提交这两个cDNA序列，获得的登录号分别为DQ211096和DQ211095。通过Mega3.1软件的Neighbor-joining程序对CYP基因的部分cDNA序列(439bp)和氨基酸序列(145AA)进行比对分析并绘制进化树，根据CYP1A部分蛋白的系统发育关系，在进化上可以将参与比对的真骨鱼划分为四个主要的分支。分析结果还发现CYP1A蛋白的两个保守区域所含的半胱氨酸可能对CYP1A蛋白结构的折叠具有特殊意义。 6.草鱼细胞CYP1A基因表达的诱导研究：在半定量PCR反应参数研究中，对关键的退火温度和循环次数进行了优化，结果显示退火温度为57C，循环次数为30次较为合适，该条件下Gauss迹量的CYP1A/ACT比值能更准确的反映CYP1A基因的表达水平。对照组和诱导组草鱼细胞中ACT和CYP1A基因cDNA扩增结果表明，细胞中CYP1A基因的基础表达量较低，而BNF诱导使GCL、CIK和CO细胞中CYP1A的表达水平得到显著的提高。GCL、CIK和CO细胞三者之间诱导后CYP1A的表达水平有显著差异(P＜0.05)，诱导表达量大小顺序为GCL＞CIK＞CO。草鱼细胞系的相应组织中ACT和CYP1AcDNA扩增以及电泳的结果与细胞中较为相似，组织中CYP1A诱导表达量大小顺序也与相应的细胞相同：肝＞肾＞卵巢。比较分析的结果表明，CYP1A基因在体内与体外的诱导表达水平具有一定的相关性。在不同细胞中BNF诱导均导致P450含量、EROD酶活和CYP1AmRNA相对含量在不同程度上得到提高，这表明诱导剂可能通过刺激CYP1A的表达，增加细胞中CYP1A的蛋白含量，从而在转录以及转录后水平上影响CYP1A依赖的EROD酶活。

目录

文摘

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引言

第一部分鱼类细胞药物代谢研究基础参数的确立 第一章鱼类细胞药物代谢能力基本指标的检测

第一部分鱼类细胞药物代谢研究基础参数的确立 第二章鱼类细胞的生长特性及药物敏感性的研究

第二部分鱼类细胞中药物代谢酶活性的诱导研究 第三章鱼类细胞EROD活性的诱导研究

第二部分鱼类细胞中药物代谢酶活性的诱导研究 第四章鱼类细胞恩诺沙星脱乙基酶活性的诱导研究

第三部分鱼类细胞中药物代谢酶表达的诱导研究 第五章草鱼CYP1A和ACT基因cDNA片断的克隆与鉴定

第三部分鱼类细胞中药物代谢酶表达的诱导研究 第六章草鱼细胞CYP1A基因表达的诱导研究

小结

参考文献

附录

致谢