斑马鱼Mylz2启动子的克隆和转荧光蛋白基因斑马鱼、唐鱼的构建

摘要

近年来，转基因鱼研究取得长足进步，外源蛋白在转基因鱼中的表达量得到显著提高，初步突破了转基因鱼走向市场的技术障碍。转绿色荧光蛋白基因青()首先实现了商品化，转红色荧光蛋白基因斑马鱼在美国获准进入观赏鱼市场，向采用转基因技术培育观赏鱼新品种迈出了重要的一步。唐鱼是我国特有的小型鲤科鱼类，在观赏鱼界占有重要地位。为了探讨开发具有较高观赏价值的转基因唐鱼的可行性，本研究尝试利用转基因技术，分别将红色和绿色荧光蛋白基因转入斑马鱼和唐鱼受精卵，并使其在肌肉组织特异性高效表达。结果表明，转红色荧光蛋白基因唐鱼在普通光下体色呈现鲜红色，肉眼可见荧光，与野生型有明显区别，在紫外光下则发出强荧光，观赏价值得到明显的提高，为利用转基因技术开发新的观赏鱼品种打下了基础。1.斑马鱼肌球蛋白轻链2(mylz2)启动子的克隆及荧光蛋白表达载体的构建　　采用PCR(聚合酶链式反应)方法，从斑马鱼基因组DNA中分离得到了斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子基因。该启动子为肌肉特异性启动子，大小为1936bp，包含了1个TATA框、4个MEF2结合位点和6个与bHLH转录因子相结合的E-框(CANNTG)。　　采用显微注射方法，将线性化的绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-mylz2)和红色荧光蛋白表达载体(pDsRed-mylz2)分别导入斑马鱼和唐鱼受精卵中，获得了转绿色荧光蛋白基因斑马鱼(出膜率为52.8％，观察到荧光的胚胎数占注射存活胚胎总数的7.2％)、转红色荧光蛋白基因斑马鱼(出膜率为47.0％，观察到荧光的胚胎数占注射存活胚胎总数的17.0％)、转绿色荧光蛋白基因唐鱼(出膜率为37.4％，观察到荧光的胚胎数占注射存活胚胎总数的7.2％)和转红色荧光蛋白基因唐鱼(出膜率为36.9％，观察到荧光的胚胎数占注射存活胚胎总数的25.9％)。

目录

文摘

英文文摘

引言

1绿色、红色荧光蛋白简介

2斑马鱼、唐鱼简介

3几种常用的转基因方法

4国内外转基因鱼研究进展

5转基因动物的应用

6转基因动物面临的问题

7本研究的课题背景、研究意义、思路和技术路线

8技术路线

第一章 Mylz2启动子的克隆和序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1基因组DNA完整性的检测

2.2 PCR扩增结果

2.3扩增产物与T载体的连接及转化重组子的筛选

2.4序列测定及分析

3小结

第二章 绿色和红色荧光蛋白表达载体的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 mylz2启动子的PCR改造和内切酶消化

2.2绿色荧光蛋白基因表达载体的筛选与鉴定

2.3红色荧光蛋白基因表达载体的筛选与鉴定

3小结

第三章 转荧光蛋白基因斑马鱼的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1注射用DNA的前处理

2.2转绿色荧光蛋白基因斑马鱼的获得

2.3转红色荧光蛋白基因斑马鱼的获得

2.4 F1代转基因鱼的检测

3小结

第四章 转荧光蛋白基因唐鱼的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1注射用DNA的前处理

2.2转红色荧光蛋白基因唐鱼的获得

2.3转绿色荧光蛋白基因唐鱼的获得

3小结

第五章 讨论

1外源DNA浓度对胚胎存活率和转基因阳性率的影响

2荧光蛋白表达量的变化趋势

3红色荧光与绿色荧光蛋白的比较

4有待解决的问题

参考文献

附录A常用试剂与缓冲液的配制

附录B部分实验方法

附录C荧光蛋白表达载体构建示意图

致谢