壳聚糖基可注射纳米复合水凝胶的改良及生物学应用

摘要

近年来，组织工程在组织和器官的缺损修复中表现出越来越大的潜力，基于三维支架材料的研究成为研究者们探寻的热点。传统的支架材料修复过程中会造成较大的创伤以及二次感染，可注射水凝胶应运而生，使解决这些问题成为了可能。但这一类人工合成材料对于组织再修复中血管形成的影响及组织修复能力还缺乏深入的研究。基于以上所述，本实验将前期制备的壳聚糖基可注射纳米复合水凝胶作为目标材料，但细胞在凝胶中不能很好的粘附铺展和增殖，RGD作为一种常用的刺激细胞粘附的肽序列能为细胞提供粘附位点，因此在凝胶中添加RGD对其进行改良，得改良后的纳米复合水凝胶，研究其对内皮细胞（EC）和间充质干细胞（MSC）的生长影响，同时利用动物模型来研究纳米复合水凝胶材料的血管化性能及对组织修复的促进作用。 在壳聚糖基纳米复合水凝胶表面接种EC，研究了其对EC的增殖影响，细胞AO染色结果表明细胞在凝胶中的形态为圆球形，未出现铺展开，在纳米复合凝胶中的cck-8结果显示EC能够继续增殖；同时研究了EC在纳米复合水凝胶中的迁移，结果显示纳米水凝胶能有效促进EC的迁移。将壳聚糖基水凝胶加入不同浓度的RGD后研究细胞在水凝胶中的生长状况，AO染色结果表明细胞在RGD的浓度为2000ug/ml时出现铺展，且cck-8结果表明添加RGD后与空白水凝胶相比能促进细胞的增殖，因此将EC应用的RGD浓度设定为2000ug/ml。将壳聚糖基纳米水凝胶中加入浓度为2000ug/ml RGD后研究其对EC的生长影响，结果显示EC能在改良的纳米复合水凝胶中大面积铺展且与平滑肌细胞（SMC）共同培养时有管状结构出现。 将MCS接种在加入不同浓度RGD改良后的壳聚糖基水凝胶中进一步研究其对MSC生长的影响，鬼笔环肽染色结果显示RGD的量为1000ug/ml时MSC开始铺展，cck-8结果显示RGD能促进MSC的增殖。将MSC接种在RGD浓度为1000ug/ml的改良壳聚糖基纳米复合水凝胶中，结果显示MSC能在水凝胶中大面积铺展生长，且与SMC共培养时出现管状结构。 成功的构建了鸡胚尿囊膜（CAM）模型，并做了HE染色，结果显示改良壳聚糖基纳米复合水凝胶材料能促进鸡胚中细胞的迁移和组织中血管的生成。对大鼠皮下实验进行CD68、Ly6g和Collagen I免疫组化染色，结果显示组织对水凝胶炎症反应较小且在改良纳米复合水凝胶中开始有胶原化。进一步建立了大鼠心肌梗死（MI）模型，超声结果显示改良纳米复合水凝胶组大鼠心功能恢复较好；HE、Masson染色结果表明改良壳聚糖基纳米复合水凝胶能促进MI修复；KI67结果表明心肌细胞在改良纳米复合水凝胶组中有增殖活性。 综上所述，改良壳聚糖基可注射纳米复合水凝胶拥有良好的生物学性能，能促进细胞的增殖及铺展，且具有促进血管生成和组织修复的性能，本实验为今后壳聚糖基纳米复合水凝胶的广泛应用提供了充分的理论基础。

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