微绿球藻基因组文库的构建及其△6-去饱和酶基因片段的克隆

摘要

用F/2培养液作为培养基,在恒温光照培养箱内用500 mL三角烧瓶培养微绿球藻(Nannochloropsis oculata),控制温度25℃,海水比重为1.020,连续光照,光强70 μmol·m<'-2>·s<'-1>微绿球藻生长到对数期后离心收集,冷冻干燥后用直接转甲酯法抽提脂肪酸,经气相色谱分析发现该藻富含二十碳五烯酸(EPA)而不含二十二碳六烯酸(DHA).用CTAB法提取对数生长期收集的微绿球藻基因组DNA,所提取的基因组DNA经752型紫外分光光度计检测OD<,260>/OD<,280>值在1.82~1.89之间,琼脂糖凝胶电泳可知大小为23kb左右.超声波处理基因组DNA后大部分分子大小在1.6~3kb之间,经T4DNA聚合酶补平后,用QIAquick胶抽提试剂盒回收,回收后DNA浓度为30ng/μL.超螺旋pUC18 DNA经SmalI酶切、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸处理后产生线形质粒DNA的浓度为25ng/μL.将回收后的基因组DNA片段与pUC18/SmalI+CIP连接,形成重组DNA分子.将此DNA分子感染大肠杆菌DH10B感受态细胞,取100μL菌液涂平板,得到大约100个克隆.根据集胞藻(Synechocystis sp.)△6-去饱和酶基因序列,设计两条引物(p1、p2),以基因组DNA为模板进行PCR扩增.结果得到一条大小在900bp左右的扩增条带.PCR产物经QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后与pGEM-T载体进行连接,连接产物转化感受态细胞后,涂布LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板,结果形成蓝白斑.随机挑选8个白色克隆,以pGEM-T载体克隆位点两端的通用引物(T<,7>、SP<,6>)进行PCR扩增,结果得到大小在900~1031bp之间的扩增条带.

目录

引 言

第一部分微绿球藻的培养及其脂肪酸的测定

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2方法

1.2结果

1.3讨论

第二部分微绿球藻基因组文库的构建

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1 基因组DNA的提取

2.2.2基因组DNA超声波处理

2.2.3 DNA片段末端平滑化

2.2.4质粒载体DNA的酶切和去磷酸化处理

2.2.5重组子的形成

2.2.6质粒的抽提

2.2.7质粒酶切鉴定

2.3讨论

第三部分微绿球藻△6-去饱和酶基因片段克隆及序列分析

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 基因组DNA PCR扩增

3.2.2重组子的鉴定

3.2.3对所测序列进行分析

3.3讨论

结论

参考文献

附录1：BLAST结果

附录2

致 谢