暗纹东方鲀体内细菌类群组成分析及产河鲀毒素菌株的筛选

摘要

关于河鲀鱼体内河鲀毒素的起源，至今为止仍无定论。近二十年来，大量研究发现寄生于鱼体内的部分细菌被证实能够产河鲀毒素。许多研究者认为这些细菌主要是通过食物链进入鱼体。为了了解饵料对鱼体内细菌组成的影响，本文以暗纹东方鲀为研究对象，通过对投喂不同饵料的鱼体部分组织肠道、表皮、性腺和肝脏中细菌类群组成分析，并对其中特异的弧菌组成作了进一步分析，来探讨饵料对各组织内细菌类群组成影响。然后试图通过分离到产河鲀毒素细菌，为今后研究河鲀毒素产生机制作基础。本文在研究鱼体内细菌组成时采用PCR-DGGE分子生物学策略以分析16SrDNA特征序列对细菌类群进行鉴定，并结合培养、未培养的细菌类群组成差异进行分析。主要研究结果如下： 1.暗纹东方鲀的肠道、表皮、性腺和肝脏组织的细菌组成。共得到80种不同细菌，其中未经培养而直接来源于组织样品的细菌为34种；经选择性培养基PCA、TCBS培养后的混合细菌中共获得49种，其中3种与未培养的完全一致。在对直接来源于组织中的34种不同细菌的16SrDNA特征序列分析，结果表明，占优势的是γ亚群的变形细菌(γ-Proteobacteria)，共17种，占50％；其次为低G+C含量的G+细菌，8种，占23.5％；CFB类仅3种，占8.8％；此外，α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、螺旋体类及高G+C含量的G+细菌各1种；而培养后的细菌几乎都是γ-Proteobacteria类细菌，仅在TCBS培养基上获得5株低G+C含量的G+细菌。其中肠道内未经培养的细菌主要有：低G+C含量的G+细菌(6种，占46％，归属于芽孢杆菌属、乳球菌属、肉杆菌属和毛球菌属)、γ-Proteobacteria(4种，占31％，归属于希瓦菌属和弧菌属)以及ε-Proteobacteria、β-Proteobacteria和螺旋体类；表皮中含有：γ-Proteobacteria(10种，占55.6％，归属于气单胞菌属、希瓦菌属、假交替单胞菌属以及假单胞菌属等)、CFB类细菌(3种，占16.7％，归属于拟杆菌纲和黄杆菌科)、低G+C含量的G+细菌的乳杆菌属(2种)以及各1种的α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和高G+C含量的G+细菌的考克氏菌属；性腺和肝脏组织中，γ-Proteobacteria(13种，占52％，分别归属于沙雷菌属、弧菌属、希瓦菌属、假交替单胞菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等)、低G+C含量的G+细菌(7种，占28％，集中在芽孢杆菌属、乳球菌属、肉杆菌属和乳杆菌属)、CFB类的黄杆菌科细菌以及α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和高G+C含量的G+细菌。 不同组织间细菌类群差别，肠道与性腺肝脏组织及表皮中细菌组成差别较大，而后两者之间差别不大。主要表现在肠道中含有特有的ε-变形细菌和螺旋体类细菌，但是，未分离到CFB类和高G+C含量的G+细菌。 2.不同饵料喂养的暗纹东方鲀的肠道、表皮、性腺和肝脏组织的细菌组成的差别。肠道内以天然饵料鲜活鱼虾饲养的暗纹东方鲀(N组)与人工饵料饲养的暗纹东方鲀(C组)差别较明显：N组包含乳球菌属、肉杆菌属、芽孢杆菌属、希瓦菌、弧菌以及α-Proteobacteria和β-Proteobacteria类细菌；而C组则包括螺旋体、低G+C含量的G+细菌毛球菌属、ε-Proteobacteria和弧菌属。性腺和肝脏、表皮内差别不是很显著。 3.不同饵料喂养的暗纹东方鲀的肠道、表皮、性腺组织的弧菌组成。共鉴定出暗纹东方鲀体内18种细菌，其中7种为未培养细菌类特有的，约占39％。所有细菌均归属于变形细菌(Proteobacteria)的gamma亚群，其中13种为弧菌科细菌，3种为肠杆菌科细菌，2种为气单胞菌属细菌。经不同饲料喂养的河鲀各组织的细菌组成的差异性，肠道最大，性腺次之，表皮最小。 4.产河鲀毒素细菌分离。从暗纹东方鲀肠道等组织中共分离到30株单菌落，经初步检测，证明菌株Ne3能够产河鲀毒素。通过对Ne3菌株的部分生物学特征鉴定并结合16SrDNA全长序列的遗传学分析，认为该菌株为假单胞菌属或丛毛单胞菌属或交替单胞菌类细菌。

目录

文摘

英文文摘

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第1章引言

第2章投喂不同饵料的暗纹东方鲀体内细菌类群组成分析

第3章暗纹东方鲀体内弧菌类群菌落组成分析

第4章产河鲀毒素菌株的筛选和初步鉴定

参考文献

硕士期间发表文章

附录Ⅰ:主要试剂

附录Ⅱ:DNA测序序列

附录Ⅲ:16S rDNA序列分析结果

致谢