宏基因组文库高通量筛选古盐井中嗜盐微生物耐盐基因

摘要

耐盐工程菌的选育一直是生物耐盐工程研究的重点和热点。随着生物技术的发展，通过DNA重组和转基因技术向微生物体中导入耐盐基因，已成为提高微生物耐盐胁迫的重要途径。因此，耐盐基因材料的筛选对耐盐基因工程育种就显得尤为重要。
　　 盐生生物是耐盐基因筛选的重要对象。盐井作为一种特殊的人造高盐环境，其间分布着大量的嗜盐微生物。在漫长的高盐胁迫过程中，嗜盐微生物逐渐形成了一套高效的感应和传导盐胁迫的信号系统，并能特异性地表达一些基因以响应环境的盐胁迫。其中，耐盐蛋白是嗜盐微生物外排钠离子、降低盐害、提高耐盐特性的一种关键性输出系统，耐盐蛋白的有无及其活性的高低与嗜盐微生物的耐盐特性密切相关。因此，本研究利用宏基因组文库从盐井中筛选耐盐基因，以期为耐盐工程菌的选育提供基因材料。
　　 在本研究中，向采集的盐卤样品中加入1％的酪氨酸，在30℃、150r/min光照培养14～30天以富集菌体，然后提取总DNA，用Mbo I酶切后胶回收1～10kbp片段与Bam HI酶切并去磷酸化的载体pUC18连接后，电转化入耐盐基因缺陷菌株E.coliKNabc，构建宏基因组文库。以0.2mol/LNaCl为筛选因子筛选耐盐基因。实验中筛选到了98个耐盐克隆子，其包含的外源DNA片段主要集中在1～2kbp，其包含的耐盐基因编码的蛋白分别属于AdoMet_MTases superfamily、AAT-I superfamily、PMSR superfamily、OM-channels superfamily和ArsB/NhaD permease superfamily蛋白家族，其中编码蛋白属于ArsB/NhaD superfamily蛋白家族的基因(accession：JN168102)为ArsB膜转运蛋白基因，命名为K-ArsB，含有该基因的耐盐克隆子命名为E.coliK-ArsB，该基因编码蛋白命名为K-ArsB。
　　 对筛选到的耐盐基因K-ArsB进行生物信息学分析，结果表明：K-ArsB包含1个长993bp的开放阅读框，编码330个氨基酸，其转录起始密码子为ATG、转录的终止密码子为TAG、-10区保守序列为GTTAAT、-35区保守序列为TTGAT、SD序列为AGGAGG；PSIPRED分析表明，K-ArsB编码的氨基酸多数以a螺旋形成二级结构，少数以无规卷曲形成二级结构，没有β折叠；K-ArsB编码的蛋白质的理论等电点为pH7.02，平均分子量为34999.81Da，属于ArsB/NhaD permease superfamily蛋白家族，与数据库中Klebsiella sp.MS 92-3的ArsB(accession：ZP_08303599)相似性为95％，Escherichia hermannii NBRC 105704的ArsB(ZP_09808970)相似性为94％，Escherichia sp.TW09308的ArsB(ZP_09461528)相似性为89％，Serratia proteamaculans 568(accession：YP_001478619)和Yersinia frederiksenii ATCC 33641(accession：ZP 04631221)的ArsB相似性为87％，该蛋白整合到细胞膜上，存在着9个跨膜区域，具有转运钠盐、砷酸盐、硫酸盐、亚锑酸盐以及有机阴离子通过生物膜的功能，在维持细胞内外的渗透压平衡中起到重要作用。
　　 通过对含有ArsB膜转运蛋白基因K-ArsB的耐盐克隆子E.coliK-ArsB进行SDS-PAGE凝胶电泳和盐碱耐受性实验发现，K-ArsB编码一种分子量约为35KD的蛋白质，能显著提高E.coli KNabe对NaC1和碱性pH的耐受能力，是一个良好的耐盐基因。本研究对于理解古盐井中嗜盐微生物的嗜盐机制，开发古盐井中的基因资源及寻找新的耐盐基因具有重要意义。