应用DGGE技术研究低分子量聚乙烯粉末对土壤细菌遗传多样性的影响

摘要

随着我国农业的迅速发展，中国农用塑料薄膜产量整体保持稳步增长的态势，但随之而来的一个问题就是如何处理这些使用过后的农用塑料薄膜。在国家大力推行环境保护的背景下，要求我们走绿色、环保之道，因此，可降解农用塑料薄膜的研究成为农业可持续发展中的一项重大任务。在自然状况下环境降解地膜能够在较短的时间内碎片化，并能够进一步有残碎片降解为分子量更低的粉末状或颗粒状残留物。这类残留物仍然具有极强的疏水性，在短时间内很难被完全降解掉。因此，这些降解后的残留物对土壤生态系统有什么样的影响就成了一个新的课题。本研究就在这样一个新课题中产生的。对于这样一个课题，前人有少量研究，且是关于这些残留物对土壤中农作物的影响。土壤微生物多样性是土壤生态系统的重要组成部分，因此研究这些残留物对土壤微生物多样性的影响就成了一项重要课题。
　　本研究中，首先利用添加有低分子量聚乙烯(LMWPE)粉末的土壤进行农作物盆栽试验。然后利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术研究低分子量聚乙烯粉末对盆栽土壤微生物多样性的影响。通过以上方式来模拟农膜降解残留物在农田中的分布情况以及农膜残留物对农田生态系统土壤微生物多样性的影响。在本实验中，分别向盆栽土壤中添加3种分子量的LMWPE(2000，5000，100000)，且每种分子量LMWPE含有5种不同累积量（1年，5年，10年，50年，100年）的处理为实验组。另外，以栽培有农作物的土壤中不加入LMWPE的处理作为空白对照组(CK)，共得到16个处理，每个处理设置3个平行。其中分别以2K，5K，10W作为3种LMWPE分子量的简称。每种LMWPE累积量的具体含义为，每千克土壤中累积残留聚乙烯粉末的重量。其对应的具体值分别为0.04241g·kg-1、0.21205g·kg-1、0.4241g·kg-1、2.1205g·kg-1和4.2410g·kg-1，分别用1Y，5Y，10Y，50Y，100Y作为5种LMWPE累积量的简称。所有16个处理的简称分别为CK,2K1Y,2K5Y,2K10,2K50Y,2K100Y,5K1Y,5K5Y,5K10Y,5K50Y,5K100Y,10W1Y,10W5Y,10W10Y,10W50Y,10W100Y。
　　本文将分三个部分对整个实验进行阐述:
　　(1)首先根据小白菜的不同生长时期（定植后第21天、第35天）对添加有LMWPE的土壤样品进行分批次采集，共采集了2批土样。即第1批次样品为定植后第21天采集的土样，共16个处理的样品;第2批次样品为定植后第35天采集的土样，共16个处理的样品。每个土样经冷冻真空干燥后进行提取土壤总DNA的提取与检测。
　　(2)通过对PCR Taq MasterMix的筛选、添加的合适PCR辅助剂以及在16SrDNA v3区基因片段扩增过程中降落PCR的应用及优化，得到了特异性高，条带单一的满足DGGE需求的PCR片段。
　　(3)在30％和60％浓度的变性剂组合及80v12h的电泳条件下进行DGGE，经合适的银染步骤得到DGGE指纹图谱。然后采用Bio-Rad公司的Quantity One软件对DGGE指纹图谱进行分析，相似性分析和聚类分析。分析结果如下:
　　1)在土壤微生物多样性方面，第1、2批次添加有不同LMWPE的各个土样中，土壤微生物群落均有较高的丰富度指数，多样性指数及均匀度指数。
　　2)在添加有不同LMWPE的各个土样中，第1批次和第2批次内不同处理土样细菌群落间的相似度都较高，都超过了60％。不同实验组之间，实验组与对照组之间无特定的分类规律，且差异性不大。
　　通过最终分析，利用DGGE技术结合盆栽模拟实验，在种植有小白菜的土壤中，暂未发现LMWPE粉末的加入对土壤微生物多样性有较明显的影响。

目录

声明

摘要

第1章 前言综述

1．1 研究背景及意义

1．1．1 农膜降解物在土壤中的残留

1．1．2 国内外现状分析

1．1．3 可降解地膜存在的问题

1．1．4 土壤微生物的角色

1．1．5 土壤微生物多样性的含义及研究意义

1．1．6 土壤微生物遗传多样性的含义及角色

1．1．7 课题研究意义

1．2．1 土壤微生物多样性的研究方法及其特点

1．2．2 DGGE的起源及应用

1．2．3 DGGE原理及技术分析

1．2．4 选择DGGE的必要性

1．3 研究思路、研究内容及研究路线

1．3．1 研究思路

1．3．2 研究内容

1．3．3 技术路线

第2章 土壤DNA的采集、提取及检测

2．1 引言

2．1．1 土壤DNA的提取

2．1．2 土壤基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

2．2 材料

2．2．1 实验原材料

2．2．2 实验主要试剂

2．2．3 实验主要耗材及仪器

2．2．4 试剂的组成、配制及使用

2．3 方法

2．3．1 实验样品的设计

2．3．2 实验样品的采集

2．3．3 土壤DNA的提取

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳的检测

2．3．5 核酸OD值的检测

2．4 实验结果分析

2．4．1 土壤基因组电泳条件探索

2．4．2 核酸OD值的检测

2．5 本章小结

第3章 16S rDNA v3区基因PCR扩增及条件优化

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 试剂

3．2．2 仪器及耗材

3．2．3 试剂的组成、配制及使用

3．3 方法

3．3．1 退火温度初步探索

3．3．2 PCR辅助剂DMSO对PCR的影响

3．3．3 BSA对PCR的影响

3．3．4 比较两种辅助剂DMSO与BSA对PCR的影响

3．3．5 循环条件重复性验证

3．4 结果与分析

3．4．1 退火温度初步探索

3．4．2 PCR辅助剂及退火方式的筛选

3．5 本章小结

第4章 DGGE电泳及多样性分析

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 DGGE所需试剂

4．2．2 DGGE所需仪器耗材

4．3 方法

4．3．1 DGGE电泳及染色剂凝胶成像分析

4．3．2 DGGE图谱分析

4．4 结果与分析

4．4．1 第1批细菌16S rDNA基因的PCR-DGGE

4．4．2 第2批细菌16S rDNA基因的PCR-DGGE

4．5 本章小结

4．6 结论

第5章 讨论

参考文献

致谢