玉米分离群体中糯质基因（waxy）和超甜基因（shrunken-2）基因的特异PCR鉴定

摘要

玉米的Waxy基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS Ⅰ),决定玉米胚乳和花粉中的直链淀粉合成.普通玉米(WxWx)籽粒中的淀粉由直链淀粉(约25﹪)和支链淀粉(约75﹪)组成.糯玉米(wxwx)子粒中几乎不含直链淀粉,全由支链淀粉组成.因为不同转座子插入基因序列的不同位点,Wx基因突变成了各种不同的等位基因,使其编码颗粒凝结型淀粉合成酶的结构各不相同,活性界于5﹪至95﹪之间.该研究根据Waxy基因位点等位突变的原理,以野生型Wx基因为模板,设计一套特异PCR引物,分段扩增Waxy基因,并使扩增片段首尾重叠,以利对各种等位突变进行序列分析.结果表明,用上游引物P1(5′-GGCGTACGAGGAGATGGTGAGGAA-3′)和下游引物P2(5′-CGAAACAAACAGGGCCAAAGATAG-3′)进行特异PCR扩增,可在Waxy基因的3′端(4054-4760bp)检测出多态性差异,用以对糯玉米与普通玉米杂交的F2分离群体直接进行基因型检测,可在苗期区分糯质与非糯质分离单株.从130株F2分离群体中,检测出97个非糯质单株,33个糯质单株,与成熟后对籽粒进行碘液染色鉴定的结果完全相符,经χ<'2>检验也符合3:1的分离规律.用此套引物对19个不同的糯玉米自交系进行特异PCR扩增,分析Waxy基因位点的多态性差异.结果表明,自交系R5至R19的突变位点相同,在Waxy基因的3′端(4054-4760bp);R1和R3的突变位点在Waxy基因的5′端(223-1864bp);R2和R4的突变位点在Waxy基因的5′端(1696-2721bp).淀粉组成分析表明,自交系R5至R19支链淀粉在淀粉总量中所占的百分比间差异不显著,而各自交系产量间差异显著.玉米的Shrunken-2基因编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPP)的大亚基.因为转座子的插入,Shrunken-2基因突变为隐性shrunken-2,使淀粉合成受阻,籽粒内大量积累可溶性糖,表现为超甜玉米.该研究以显性Shrunken-2基因为模板,设计特异PCR引物,对超甜玉米自交系和普通玉米自交系进行多态性检测,发现超甜玉米的隐性突变位点位于Shrunken-2基因的1706-2669bp之间,用上游引物P1(5'-TGTATTCTTA CCTCAGATGC-3')和下游引物P2(5'-TCATAGGAATATCAATAAGC-3')可对显性Shrunken-2基因与隐性shrunken-2基因直接进行基因型检测.

目录

获《雅安三九药业奖学金资助》

第一章文献综述

1.1糯玉米的应用

1.2糯玉米育种的研究

1.3糯玉米的遗传研究

1.4糯玉米的分子机理研究

1.5米淀粉代谢研究概况

1.6玉米胚乳突变基因与淀粉遗传修饰

第二章材料和方法

2.1 材料

2.2 DNA提取

2.3对糯玉米waxy基因序列的分析

2.4对糯玉米waxy基因部分片段的扩增

2.4.1部分片段的扩增引物设计

2.4.2引物扩增的循环参数

2.4.3 PCR产物的凝胶电泳

2.5重叠引物的设计

2.5.1反应体系

2.5.2循环参数

2.5.3电泳

2.5.4碘检检测

2.6对超甜玉米Shrunken-2基因的PCR检测

2.6.1引物设计

2.6.2循环参数

2.6.3反应体系

2.6.4电泳

2.7对子粒淀粉含量的测定

2.7.1旋光仪法测定总淀粉

2.7.2支链淀粉含量测定

第三章结果与分析

3.1对糯玉米waxy基因序列分析的结果

3.2对糯玉米waxy基因部分片段的扩增的结果

3.3玉米分离群体中waxy基因的PCR检测结果

3.4对部分自交系籽粒淀粉含量的测定

3.5部分糯玉米自交系单穗籽粒产量

3.6对shrunken-2超甜基因PCR鉴定结果

讨论

致谢

参考文献