超氧化物歧化酶基因（Mnsod）和抗逆相关转录因子基因（dreb）在玉米中的表达研究

摘要

为研究过量表达的超氧化物歧化酶基因(Mnsod)对提高玉米抗氧化损伤的作用,该研究构建了小麦来源Mnsod基因的单子叶植物表达载体,用基因枪法转化用优良玉米自交系诱导的胚性愈伤组织.通过梯度浓度潮霉素筛选,从阳性愈伤分化再生植株.PCR、Southern杂交和SOD酶活性电泳检测表明,5个玉米基因组中己整合外源基因,部分转基因植株过量表达了外源蛋白,转基因株系中的MnSOD酶活性是未转基因对照植株的3倍以上.其中,活性最高的株系达到对照的9.4倍.甲基紫精进行氧化损伤处理后,用电解质渗漏率法检测转基因植株的抗氧化能力.除一个株系以外,其他株系的电导率均小于对照,株系2与对照的差异达极显著水平(P<1﹪).由此表明,过量表达超氧化物歧化酶(MnSOD)的转基因株系,在逆境条件下的抗氧化能力明显提高,可用于培育耐旱、耐盐、耐寒的抗逆品种.为了探讨干旱、高盐及低温胁迫信号在植物细胞中传递和应答基因表达调控的机理,对抗逆相关调控因子的研究成为近年来植物分子生物学研究的热点.在许多抗逆基因的启动子中都含有DRE顺式作用元件,其核心序列为CCGAC,该序列被抗逆相关转录因子DREB特异识别和结合,启动下游基因的表达.所以,转录因子DREB的过量表达,可以诱导含DRE顺式作用元件的所有抗逆基因的表达,提高作物广谱抗逆性.该研究通过特异PCR扩增,从小麦中克隆逆境诱导表达启动子mwcs120,与wcs120启动子序列的同源性为97.1﹪,有两个位点发生了突变,而逆境调控保守元件的序列未发生改变.对gus基因瞬时表达实验表明,在单子叶和双子叶植物中,mwcs120启动子均受低温和高盐逆境诱导,启动结构基因的表达,显示其在作物抗逆基因工程改良中的应用前景.目前,该启动子序列已在GENBANK注册,序列号为AY493570.分别用诱导型启动子mwcs120和组成型启动子ubiquitin,启动抗逆相关转录因子基因dreb,构建单子叶植物诱导型和组成型表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织.通过梯度浓度潮霉素筛选,从阳性愈伤分化再生植株.PCR检测获得4株用诱导型表达载体转化的植株和2株用组成型表达载体转化的植株,为进一步研究抗逆相关转录因子基因dreb在单子叶中的表达调控,培育抗逆玉米材料打下基础.

目录

摘要

Abstract

第一章文献综述

1植物产生抗逆性的分子机制

1.1逆境诱导表达的基因

1.2逆境诱导基因的表达调控

1.3逆境信号的感受和传导

2抗逆基因工程

2.1抗逆基因工程的基本策略

2.2抗逆基因工程研究进展

2.3抗逆基因工程中存在的问题

3 DREB与抗逆基因工程

4 SOD与抗氧化基因工程

4.1活性氧的种类

4.2氧自由基对植物的危害

4.3活性氧的清除

4.4高等植物抗光氧化的研究进展

5本研究的目的和意义

第二章材料与方法

1实验材料

1.1植物材料

1.2菌株

1.3质粒

1.4重要仪器设备

1.5重要的生化试剂

1.6玉米转化培养基配方

2方法

2.1逆境诱导启动子mwcs120的克隆及功能鉴定

2.2DREB和SOD单子叶植物表达载体构建

2.3玉米基因枪转化及植株再生

2.4再生玉米植株的PCR检测

2.5转sod基因的玉米植株的Southern Blot检测

2.6T1代转sod基因阳性玉米植株的获得

2.7 MnSOD的凝胶电泳及活性检测

2.8转基因植株后代抗氧化损伤性能的测定

第三章结果与分析

1结果

1.1逆境诱导启动子mwcs120的克隆及功能鉴定

1.2 DREB和SOD单子叶植物表达载体构建及鉴定

1.3转基因玉米植株的获得

1.4再生植株的PCR检测

1.5转sod基因再生植株的Southern Blot检测

1.6 T1代转sod基因植株的获得

1.7MnSOD凝胶电泳及活性检测

1.8MV处理后转sod基因植株的电解质渗漏率测定

2讨论

2.1超氧化物歧化酶基因Mnsod在玉米中的过量表达及对提高抗氧化损伤性能的作用

2.2转录因子基因dreb在玉米中的组成型和诱导型表达

2.3抗逆基因工程存在的问题及解决方法

参考文献

附录

致谢